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[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
孙国荣 马少鸿 林桂香 万小菊 黄郁葱 简纪常 蔡双虎
基于荚膜多糖cpsA基因设计引物，建立海豚链球菌可视化环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，以快速检测鱼类养殖中的海豚链球菌。结果表明，LAMP最佳反应条件为65 ℃反应20 min，镁离子浓度为1.2 mmol/L、dNTPs浓度为0.64 mmol/L、内外引物比例为 16:1；特异性检测结果表明：该方法能特异性检出海豚链球菌，对无乳链球菌和其他14种菌检测结果均呈阴性；灵敏度检测结果表明，该LAMP方法灵敏度为21.2×10~(-6) ng/μL，比PCR检测方法灵敏度高100倍；适用性分析结果表明，该LAMP方法在模板中存在鱼类基因组干扰下也能正确完成检测。研究中建立的LAMP检测方法为海豚链球菌的检测提供一种可视化、灵敏、成本低的快速检测技术。
关键词：
海豚链球菌cpsA LAMP 可视化检测
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
甘西 陈明 余晓丽 李莉萍 陈汉忠 徐增辉 雷爱莹 梁万文 黄维义
为建立准确快速的海豚链球菌鉴定方法,设计合成了海豚链球菌种特异性引物CM1/CM2,进行了其特异基因片段的PCR扩增、反应条件的优化及方法的特异性和敏感性试验;同时还进行了不同检测材料的比较及9份临床样品检测。结果表明,引物CM1/CM2只能从海豚链球菌中扩增到特异性基因片段,供试的其它9种水产常见病原菌PCR扩增均呈阴性;能够检测的最低细菌数在20~30个细菌;方法可直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织检测到该菌;另外,临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析结果一致。该方法弥补了传统细菌鉴定很难将该菌鉴定到种的缺点,并显著缩短了检测时间及降低了检测成本,具有较好的应用...
关键词：
海豚链球菌 PCR 罗非鱼 诊断
[期刊] 华北农学报
[作者]
王永 赵新 景海春 兰青阔 朱珠 程奕
以无乳链球菌纤连蛋白fbs基因为主要研究对象,采取环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对fbs基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在63℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对无乳链球菌的检测工作。结果显示,LAMP方法能够特异性检测fbs基因,其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍,并与实时荧光定量PCR方法相当。所建立的针对无乳链球菌fbs基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合无乳链球菌的快速检测。
[期刊] 水产学报
[作者]
邓梦玲 耿毅 刘丹 周燕 汪开毓 黄小丽 陈德芳 余泽辉 陈成
2013年8—9月,四川雅安汉源湖养殖的西伯利亚鲟发生一种以体表溃疡、内脏出血和心外膜囊肿为特征的传染病。为明确其病因,本研究从自然发病鱼的肝、脾和肾进行了病原菌的分离、人工感染、分离菌的表型特征和分子生物学特征的检测。结果从患病鱼体内分离到一株G+链状球菌(Ab130920),人工感染实验证实了其病原性,生理生化特性与海豚链球菌(ATCC29178)基本一致;16S r DNA序列(Gen Bank登录号:KJ162337)与Gen Bank中S.iniae16S r DNA序列同源性最高,在以16S r DNA序列及其Gen Bank中同源性较高的相关序列构建的系统发育树上,分离菌与海豚链...
[期刊] 水产学报
[作者]
熊向英 黄国强 王志成 文雪
为了解近年来广西卵形鲳鲹海豚链球菌流行菌株的基因型信息以及菌株间的差异,对2015—2016年从广西地区7个养殖场的患病卵形鲳鲹体内分离得到的17株海豚链球菌菌株分别进行了基因型分析、耐药谱测定以及毒力基因检测。采用随机扩增多态性DNA标记技术(RAPD)和基因组重复序列PCR(rep-PCR)分析其基因型。结果显示,RAPD和rep-PCR指纹图谱结果一致,17株海豚链球菌可分为2种基因型。对海豚链球菌7种主要的毒力相关基因特异PCR检测,所有菌株均为sim A+scp I+pdi+sag A+cps
[期刊] 淡水渔业
[作者]
邵辰 易弋 黎娅 黄荷 伍时华 杨军
根据无乳链球菌（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕＳ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ｃｆｂ基因序列，设计、合成２对引物，优化扩增条件，建立了快速高灵敏度鉴别无乳链球菌的巢式ｐｃｒ方法。结果显示：使用该方法对罗非鱼（ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉＳ ｍｏＳＳａｍｂｉｃｕＳ）血液样品进行检测，可检测到活菌浓度为８．７×１０４ｃｆｕ／ｍ ｌ的无乳链球菌。对采自广西地区受无乳链球菌感染的１９份罗非鱼样品进行检测，１８份可获得目的片段，扩增到的序列均为无乳链球菌ｃｆｂ基因序列，检测准确度达到９４．７％。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘婵 冯娟 谢云丹 胡万涛 王江勇 苏友禄
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)作为罗非鱼主要病原,传染力强、致死率高,部分鱼从发病到死亡无明显病症,难以确定鱼体是否携带该病原菌,建立适用于生产一线的无乳链球菌检测技术势在必行。根据GenBank中无乳链球菌透明质酸酶基因(hylB)、青霉素结合蛋白基因(pon A)和CAMP因子基因(cfb)的保守序列,设计3对特异性引物,对多重PCR的反应条件和体系进行优化,建立基于毒力基因的罗非鱼无乳链球菌三重PCR检测方法,并运用该方法检测来自广东省不同地区的罗非鱼组织样品。构建的三重PCR检测方法仅在无乳链球菌中扩增出3条特异性条带,而在罗非鱼和常见的水产病原菌菌株中均未扩增出任何条带,表现出良好的特异性;以无乳链球菌基因组DNA浓度7.24×10~(–5)~5.65 ng/μl为模板进行扩增,该三重PCR能检测到的最低模板浓度为1.81×10~(–3) ng/μl,表现出较高的灵敏度;运用该方法检测188个罗非鱼组织样品,其阳性检出率与常规细菌分离鉴定阳性率一致,以常规细菌分离鉴定为标准,对该三重PCR检测方法进行评价,其诊断敏感性(Dse)和诊断特异性(Dsp)均为100%。结果表明,构建的三重PCR检测方法不仅显著提高了检测的准确度和灵敏度,还可在同一反应中同时检测3种无乳链球菌毒力基因,为无公害水产品中无乳链球菌的快速检疫、水产养殖病害早期预警提供了一种快速、精准和高效的检测技术。
关键词：
罗非鱼 无乳链球菌 毒力基因 三重PCR
[期刊] 华北农学报
[作者]
张昆丽 林本夫 席振军 杨冬霞 卞志标 宋帅 蒋智勇 蔡汝健 李春玲
为了建立一种高效、灵敏的猪链球菌(SS)检测方法,针对SS的谷氨酸脱氢酶基因(gdh)合成特异性引物,通过优化退火温度与引物浓度,经特异性、敏感性、重复性以及临床样品检测,建立了SS的纳米PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法仅能从SS的基因组序列中扩增得到687 bp的特异性序列,与猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌无交叉反应,且能同时识别1、2、7和9型4个目前流行的SS主要血清型,满足临床上多血清型SS感染检测的需要;敏感性试验结果显示,该方法对SS的最低检测下限为10 cfu/mL,与普通PCR方法相比,灵敏度提高了100倍;重复性试验表明,该方法检测效果稳定,重复性较好。用该方法和普通PCR对临床上收集的44份疑似SS感染样品进行检测,阳性率分别为72.7%(32/44),54.5%(24/44),表明该纳米PCR方法具有灵敏度高,特异性好等优点。综上,本研究建立的SS纳米PCR检测方法,能够准确、高效检测SS,为猪链球菌病的临床诊断和流行病学调查提供了技术支持。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
拜廷阳 杨增岐 吴志明 普志平 赵明军 闫若潜
【目的】建立猪链球菌9型(SS9)的快速诊断和定量分析方法。【方法】根据GenBank已登录的SS9cps9H基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了SS9的TaqMan荧光定量PCR检测方法(Taq-Man FQ-PCR),并进行了敏感性、特异性和重复性试验;利用所建立的检测方法对河南省11例疑似猪链球菌临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了对比。【结果】成功建立了SS9的FQ-PCR检测方法和定量标准曲线,FQ-PCR方法的检测灵敏度可达1.0拷贝/μL,特异性高且重复性良好;利用该方法对11份临床疑似猪链球菌感染组织病料进行的应用检测表明,其中有3份样品为阳性...
[期刊] 水产学报
[作者]
刘韬 陈德芳 段靖 王二龙 王亚军 汪开毓
为检测斑点叉尾鮰源海豚链球菌兼职蛋白(fructose-1,6-bisphosphate aldolases,FBA)的抗原性和潜在的疫苗价值,本实验克隆得到斑点叉尾鮰源海豚链球菌DX09(基因组登陆号LXQF01)的fba基因序列(基因登录号A7N10_RS06935),对克隆序列进行生物信息学分析,并通过原核表达得到重组FBA蛋白(r FBA),制备了兔抗r FBA血清用于FBA蛋白抗原性检测,同时通过免疫保护实验评估重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,海豚链球菌DX09 fba基因有1个882 bp的开放阅读框(ORF),编码293个氨基酸。生物信息学分析显示,其分子式为C_(1378)H_(2172)N_(368)O_(422)S_8,分子质量为30.9 ku,理论等电点为5.01,不具有信号肽和跨膜区域;具有保守的裂解酶结构域,且与其他来源的FBA蛋白同源性达100%;具有较高的抗原指数,表明其可形成多个抗原表位。SDS-PAGE检测发现,诱导表达的重组蛋白以包涵体的形式出现在沉淀中,大小约为47 ku。Western blot分析表明,兔抗r FBA血清能特异性结合菌体蛋白。同时免疫保护实验显示,重组蛋白对斑点叉尾鮰的相对保护率可达55%,免疫后鱼体抗体水平相对对照组显著升高。本研究表明,原核表达的斑点叉尾鮰源海豚链球菌DX09 rFBA具备较好的抗原性和免疫保护作用,具有研发斑点叉尾鮰海豚链球菌亚单位疫苗的潜在价值。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
陈国强 唐泰山 邓碧华 张敬友 张常印 陆承平
根据GenBank发表的猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly)全序列,利用O ligo(7.0)软件设计并合成了可扩增长度为495 bp的引物,从SS2参考菌株ATCC43765和SS2江苏分离株HA9801中扩增出495 bp的条带,利用HindⅢ限制性内切酶对具有相应单一酶切位点的PCR扩增产物进行酶切,获得预期的314 bp和181 bp的2个DNA片段,检测灵敏度达到2.5×102CFU.mL-1;但不能从马链球菌兽疫亚种ATCC35246、大肠埃希氏菌ATCC25922、单增李斯特杆菌ATCC19115/413、金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212中扩增出...
关键词：
猪链球菌2型 溶血素基因 PCR检测
[期刊] 水产学报
[作者]
祝璟琳 李大宇 肖炜 邹芝英 杨弘
以罗非鱼源无乳链球菌为抗原，免疫新西兰兔获得高效价的多克隆抗体；以此多克隆抗体作为一抗，羊抗兔Ｉｇ ｇ－ＨＲＰ作为酶标二抗，建立无乳链球菌的间接ＥＬＩＳＡ快速检测法。采用棋盘滴定法确定抗原与一抗的最佳工作浓度分别为１０６ ＣＦＵ／ｍ Ｌ和１∶１０ ０００；酶标二抗的最适工作浓度为１∶１０００。病原菌检测灵敏度为每孔１０３ ＣＦＵ。该方法标准化后具有快速、灵敏等特性，与海豚链球菌等其他常见水产病原菌无交叉反应；阻断实验中的阻断率达７２．０２％；交叉反应和阻断实验的结果显示该方法具有较高的特异性。将该方法标准化后检测了４４株２００７—２０１３年分离的罗非鱼无乳链球菌，阳性检测率为１００％；对人工感．．．
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
黎炯 叶星 卢迈新 邓国成 田园园 江小燕 黎坚平
根据无乳链球菌的cfb基因和海豚链球菌16SrRNA基因序列,设计、合成2对引物,优化扩增条件,建立了快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌的双重PCR方法.用该方法扩增无乳链球菌和海豚链球菌,可分别获得474、296bp的特异性片段,扩增嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌等其他常见鱼病原菌无特异性片段.该方法可实现对无乳链球菌和海豚链球菌的快速鉴别,具较高的灵敏度,可检测到基因组含量分别为3.2×10-3ng/μL的无乳链球菌和3.0×10-2ng/μL的海豚链球菌.对采集自广东与海南两省养殖罗非鱼病鱼的11份病原样品进行检测,均可获得474bp片段,测序与BLAST分析结果表明,扩增到的序列均为无乳链球菌...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
罗璋 许杰 韩进刚 徐赟霞 马文婷 冯守明
从患病濒死的银鼓鱼(Selenotoca multifasciata)肾脏组织中分离到Yg1菌株,用该菌株对健康银鼓鱼进行人工感染,可使其致病,发病症状与自然病鱼症状一致,再分离菌株的各种特性与原分离菌株相同。通过ATB系统和菌体常规形态特征、生理生化反应指标测定以及16SrRNA测序分析等综合鉴定,Yg1菌株为海豚链球菌(Streptococcus iniae)。药敏试验结果表明,Yg1菌株对恩诺沙星、土霉素、罗红霉素、强力霉素、四环素、左氟沙星等抗生素较为敏感。
[期刊] 水产学报
[作者]
祝璟琳 柒壮林 李大宇 邹芝英 肖炜 乐贻荣 韩珏 杨弘
采用光学显微镜和透射电子显微镜技术分别对患海豚链球菌病的罗非鱼的病理学变化进行了研究。分离的病原菌革兰氏染色呈阳性,透射电镜负染观察菌体球形或卵圆形,直径0.6~1.0μm,多数呈链状排列。组织学病变主要表现为全身多组织、器官水肿,出血、变性、坏死以及炎症反应,特别是肝、脾、肾和脑分别表现为肝炎,脾炎,间质性肾炎和脑膜炎。超微结构观察发现病鱼肝、脾、肾、脑、心肌和骨骼肌等器官的细胞超微结构都有较为严重的破坏,细胞核畸形,染色质浓缩或边集,粗面内质网囊泡化及脱粒,线粒体肿胀,嵴断裂或溶解消失。研究表明,海豚链球菌能造成罗非鱼全身性组织器官病变,致使器官功能障碍,正常生理代谢调节紊乱,最后导致死亡...
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罗非鱼 海豚链球菌 病理学 超微结构
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