以转基因作物中常见的nos/plamid构建特异性序列为研究对象,通过同源性比较和焦磷酸测序dispensation order设计,建立Special-Base焦磷酸测序检测模型;利用转基因大豆Roundup Ready Soybean和转基因玉米Bt11、GA21、NK603等4种转基因作物为试验材料,针对nos/plamid构建特异性序列设计引物,经复合PCR扩增及焦磷酸测序,验证Special-Base焦磷酸测序检测模型有效性。结果表明:本研究建立的Special-Base焦磷酸测序模型能检测出样品中单一或多种转基因作物成分,提高了转基因作物检测的精确性、检测通量和自动化程度。

为建立转基因大豆OsDREB3品系特异性定性检测方法,以转基因大豆OsDREB3为研究对象,通过染色体步行方法,成功获得转基因大豆OsDREB3上pCAMBIA1301质粒外源基因插入位点的5′端旁侧序列,其扩增片段覆盖了转化载体及转基因大豆基因组旁侧序列,扩增片段大小为344bp。同时根据旁侧序列设计引物,建立OsDREB3品系特异性定性PCR方法,以典型的转基因作物证明该方法检测转基因大豆OsDREB3具有高特异性,灵敏度为0.1%。

[目的]转基因大豆事件L8014是本研究前期利用农杆菌介导的大豆子叶节高效遗传转化技术体系，将来源于山菠菜的基因BADH导入大豆(Glycine max)‘Williams 82’而获得具有良好耐盐(1.5%NaCl)性状的转基因大豆(该材料已经完成环境释放试验)。T-DNA插入位点侧翼序列的获得与分析对于转基因事件的安全评价及应用非常重要，本文旨在明确该转基因大豆材料的分子特征及其检测方法，以进一步推进安全评价。[方法]利用Southern杂交检测转基因大豆外源基因的拷贝数；基于基因组重测序技术，采用BWA(Burrows-Wheeler-Alignment)方法将重测序数据与T-DNA序列以及大豆基因组序列进行比对分析。[结果]T-DNA在大豆基因组10号染色体上的基因组区间3925017—3926022位点，插入方式为反向插入；结合PCR扩增技术获得外源T-DNA整合位点的左、右边界侧翼序列，基于该序列建立了转BADH基因大豆事件L8014的特异性PCR检测方法。[结论]本研究获得了转基因事件的整合位点及侧翼序列，方法快速、结果可靠，为转基因大豆及其衍生产品的检测提供了技术支撑。

为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.83

实验根据GenBank公布的细菌全基因组数据,采用比较基因组学分析创伤弧菌与其它细菌基因组间的差异,筛选出34个潜在的创伤弧菌物种特异性检测靶标基因,其中VV1_2692、VV2_0075和VV2_0939这3个基因已有功能注释。常规PCR扩增结果显示这3个基因均具有良好的特异性和灵敏度。进而以这3个基因和传统靶基因vvhA作为检测靶标,采用常规PCR技术检测来自杭州市农贸市场的137份海产品中创伤弧菌,发现VV2_0075、VV2_0939和vvhA基因的检测结果与传统生化鉴定方法一致,表明新发掘的VV2_0075和VV2_0939基因在对海产品中创伤弧菌检测时具有很好的稳定性和很强的抗干扰...

【目的】H9亚型禽流感是重要的人兽共患性传染病,该亚型病毒为H7N9亚型和H10N8亚型流感病毒提供了6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS),并且一直处于动态重组过程中。因此,建立针对H9亚型禽流感的型特异性电化学发光免疫的高通量快速检测方法,加强H9亚型流感的监测,具有重要意义。【方法】用钌联吡啶标记H9亚型AIV的单克隆抗体,用MPI-E型电致化学发光分析系统评价钌标单抗标记效率;用生物素标记H9亚型AIV的多克隆抗体,HABA法检测抗体生物素化的效率;待测抗原与钌标单抗作用1 h后,将此抗原-抗体复合物与通过生物素-链霉亲和素系统固定在磁微球表面的多克隆抗体反应,最后加入反...

【目的】建立基于多重串联式PCR(multiplexed tandem PCR,MT-PCR)的基因碟片技术,并使之应用于转基因作物的大量、快速和稳定地检测。【方法】以转基因作物研究中常用的调控序列NOS终止子、FMV35S启动子及外源基因NPTⅡ、Cry1Ab、Cry1Ab/Ac、CP4-EPSPS、PAT和玉米内源基因IVR、棉花内源基因sad1、菜籽粕内源基因PEP为检测对象,针对每个基因设计内外2对引物,先进行一次循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重PCR,以便在均匀地扩增各基因和调控序列的同时避免引物之间的竞争,然后利用巢式荧光定量PCR检测各个基因和调控序列,最后根据...

根据 Jean-Dupouy-Camet 报道1.7 kb 基因序列而设计合成的引物,对中国9个地区(哈尔滨海伦猪株、哈尔演五常犬株、黑龙江孙吴猫株、长春犬株、沈阳猪株、河南南阳猪株、湖南十堰猪株、西安猪株、云南大理猪株)的肌组织旋毛虫 DNA 进行了聚合酶链式反应(PCR).扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,可见中国猪源旋毛虫均扩增出特异性的602bp 和230 bp 大小的 DNA 条带",而中国犬源和猫源以及正常对照肌组织 DNA 均未扩增出特异性片段.本法对中国猪源旋毛虫可检测到0.02条旋毛虫 DNA,具有高度的特异性和敏感性.

为了建立转基因大豆GTS40-3-2转化体特异性定性PCR检测方法,本研究根据已公布的转基因大豆GTS40-3-2的旁侧序列信息,用Primer 5.0软件在左右边界的结合位点处设计了5对引物组合,选取扩增片段为370 bp最佳引物组合后,优化了反应体系中引物浓度和退火温度。以Lectin为内标基因,验证检测引物的特异性及灵敏度,建立了转基因大豆GTS40-3-2转化体特异性定性PCR检测方法。结果表明,该方法成本低、效率高,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,已通过全国六家实验室的循环验证,能特异地检测大豆样品中GTS40-3-2转化体,最低限可达0.05%。研究表明,该方法满足我国转基...

随着转基因技术的迅猛发展,转基因作物及其产品的安全性问题受到广泛关注,世界各国纷纷加大了对转基因生物及其产品的管理力度。转基因检测是转基因安全管理的技术保障,本文就国内外转基因作物及产品的检测技术进行了综述,重点介绍了目前使用较广泛的PCR、ELISA等转基因检测技术的原理和特点,提出了今后转基因检测技术的发展趋势和研究方向。

根据已发表的气单胞菌16SrDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列,设计了2对引物,建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测,发现16SrDNA引物具有高度的特异性,仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97.2%,且具有高度的敏感性,可检测最低1fg的模板。将16SrDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94.4%。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径,是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方...

成本控制过程中经常存在信息不对称的情况,这种信息不对称可能会导致成本信息的失真,如基层单位的成本虚报、成本数据错误等情况,由于导致成本信息失真的因素复杂多样,失真的表现形式也各不相同,因此很难完全通过事先制定的规则来判断,这使得传统的审核方式耗时耗力,也无法完全避免错误的产生。为了解决这一问题,应用模式识别理论中的基于一类分类的理论与方法,通过选择成本信息的关键参数,构成反应该成本信息关键特征的状态向量,然后在某一高维度空间求解真实成本信息数据包络空间,来实现对成本信息失真的检测。

研究牛乳蛋白过敏儿童血清中对4种主要乳蛋白过敏原的抗体特异性情况。采用间接酶联免疫吸附法测定乳过敏儿童血清中4种乳蛋白过敏原特异性IgE抗体。结果显示,乳过敏儿童血清中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特异性IgE比例较高,特异性IgE阳性率分别可达44.3%和39.3%,其次α-酪蛋白和β-酪蛋白特异性IgE阳性率为31.2%和36.1%。研究结果表明,乳过敏儿童对4种乳蛋白过敏原都有一定比例的特异性IgE抗体,其中α-LA和β-LG的阳性率较高,是乳蛋白过敏儿童的主要过敏原蛋白,大部分乳过敏儿童不止对1种乳

【目的】鉴定福建果园西番莲上的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,Te MV),并建立用于该病毒特异性检测的分子快速检测方法,为该病毒的防治提供参考依据。【方法】采用血清学检测、电镜观察、通用简并引物RT-PCR、特异性引物RT-PCR对福建西番莲样品进行病毒检测,并对阳性样品的PCR产物进行克隆、测序;根据已报道的夜来香花叶病毒基因序列和本研究的序列测定结果,设计一对用于扩增Te MV外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长的特异性引物,通过反应条件优化,建立该病毒的特异

【目的】抗逆大豆IND-??41?-5已获得中国进口加工原料安全证书，建立一种特异、准确、灵敏的抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR(qPCR）检测方法，为抗逆大豆IND-??41?-5在中国的安全监管提供精准测量技术。【方法】首先利用Beacon designer 8.0软件对抗逆大豆IND-??41?-5转化体5′端旁侧序列设计18对引物探针，结合1对罗萨里奥农业生物技术学院公司提供的引物探针，随后采用qPCR技术对引物探针进行特异性筛选，遴选出1对候选引物探针；设置实时荧光定量PCR的引物/探针浓度梯度，优化qPCR方法的反应体系；设置不同类型的特异性测试样品测试方法的特异性；以纯合抗逆大豆IND-??41?-5基因组DNA作为标准样品，梯度稀释成标准溶液模板，绘制标准曲线，考察qPCR方法的线性动态范围，配置拷贝数比值为5%、1%和0.1%的测试样品，评价定量方法的准确性；配置拷贝数比值为0.05%和0.025%的样品，测试方法的检出限；拷贝数比值为0.1%的样品经16次定量测试，确定方法的定量限；最终确定抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法的关键技术参数。8家有资质单位对该定量PCR方法的特异性、检出限、定量限、准确性等进行验证，采用柯克伦法和格拉布斯法评估qPCR方法的重复性和再现性，利用线性最小二乘法对准确性样品测试结果的测量不确定度进行预评定。【结果】通过特异性筛查确定RBORD-F1/RBORD-R1/RBORD-P1引物探针为候选组合，建立了抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性qPCR方法，扩增片段为138 bp，优化的反应体系引物终浓度为0.4μmol·L~(-1)、探针终浓度为0.2μmol·L~(-1);IND-??41?-5和Lectin标准曲线的线性动力学范围为33—83 190 copies的基因组DNA，该方法可准确定量5%、1%和0.1%含量的IND-??41?-5测试样品，偏差和相对标准偏差（RSD）均小于25%；确定检出限为0.05%、定量限为0.1%。8家实验室间联合验证该方法稳定性好、特异性强，检出限为0.05%，定量限为0.1%，且具备良好的实验室间重复性和再现性，经测量不确定度预评定后，获得5份抗逆大豆IND-??41?-5测试样品的测量结果分别为（0.10±0.02）%、（0.53±0.09）%、（1.05±0.18）%、（2.05±0.34）%和（5.18±0.87）%，结果准确可靠。【结论】成功建立了抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法，能够实现抗逆大豆IND-??41?-5转化体成分的精准定量检测。