【目的】利用Fosmid文库功能筛选法,获得山羊瘤胃微生物源蛋白酶基因并进行原核表达。【方法】利用功能底物筛选法从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选具有蛋白酶活性的克隆子,对其进行Illumina二代测序,对预测到的基因进行功能注释,根据基因丰度结果确定后续研究的功能基因。利用大肠杆菌BL21(DE3)对功能基因进行诱导表达,对表达产物进行酶活性测定。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,将密码子优化后的功能基因分别敲入枯草芽孢杆菌C6基因组ctc位点并进行表达验证。【结果】从Fosmid文库1 700个克隆子中筛选到1个具有蛋白酶活性的阳性克隆Pro4-C5。通过二代测序技术,鉴定出3个潜在的蛋白酶基因gene0833(内肽酶,EC编号:EC3.4.21.53)、gene0196(金属内肽酶,EC编号:EC3.4.24)和gene0585(羧肽酶,EC编号:EC3.4.17.14)以及1个L-天冬酰胺酶基因(gene0683,EC编号:EC3.5.1.1)。以p ET-28a(+)为表达载体,通过大肠杆菌BL21(DE3)原核诱导表达发现,gene0585和gene0196未表达;gene0833表达的蛋白分子质量为87 ku,蛋白酶活性为10.45 U/mL;gene0683表达的蛋白分子质量为37 ku,L-天冬酰胺酶活性为88.52 U/mL,同时发现该蛋白也具有蛋白酶活性,酶活性为5.25 U/mL。将密码子优化后的gene0683和gene0833定点敲入枯草芽孢杆菌C6基因组中表达发现,gene0833未表达,gene0683表达的蛋白酶活性为109.72 U/mL,相比原始菌株(100.97 U/mL)显著提高了8.67%(P<0.01);L-天冬酰胺酶活性为31.63 U/mL,相比原始菌株(22.79 U/mL)显著提高了30.06%(P<0.01)。【结论】从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选和鉴定出了2个具有蛋白酶活性的功能基因(gene0833和gene0683),均来源于微小杆菌属(Exiguobacterium),其中gene0683在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达产物具有较高的蛋白酶和L-天冬酰胺酶酶活性。

【目的】以4只装有瘤胃瘘管的山羊为试验动物,研究不同精粗比日粮对山羊瘤胃微生态中原虫和细菌区系以及微生物蛋白微循环的影响规律。【方法】试验设精(玉米-豆饼)粗(稻草)比分别为10﹕90、30﹕70、50﹕50和70﹕30的4种日粮(A、B、C、D),采用4×4拉丁方设计进行饲喂试验,采用荧光染色细菌技术测定瘤胃原虫对细菌的吞噬速率。【结果】日粮精粗比显著影响微生物细胞的密度。原虫密度C组最高;细菌和原虫的密度A组最低;日粮精粗比显著影响原虫吞噬的速率,A、B、C、D4组的吞噬速率分别为:429.5、366.74、389.48、402.2cells·cell-1·h-1,换算为对细菌N的吞噬速率...

【目的】从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选含乙酰CoA羧化酶(ACCase)基因的克隆子,并对其全长测序和生物信息学分析。【方法】利用PCR序列驱动筛选法,从瘤胃微生物BAC文库中筛选ACCase基因,鸟枪法测定基因序列后,进行基因注释、比对和系统发育分析。【结果】筛选得到了含ACCase基因的克隆(U12),其插入片段序列(URE12)全长43 358 bp,GC含量为43.75%,经GeneMark程序预测含有38个基因,经Signature程序预测属于变形菌门。ACCase基因(Acc-32)编码159个氨基酸,与Elusimicrobium minutum的ACCase基因具有41%的相...

利用脲酶选择性培养基,从奶牛瘤胃微生物BAC文库的15 360个克隆中筛选得到了12个脲酶克隆。利用酚-次氯酸法对脲酶克隆子的酶学性质分析,表明均具有不同的尿素分解能力,酶的活力范围是30~2 466 U/mg。脲酶阳性克隆插入片段大约是60 kb,限制性内切酶HindⅢ酶切图谱表明,各个克隆具有不同DNA片段,其中脲酶Urease 1、Urease 3、Urease 4和Urease 9的最适pH8.0,最适温度为60℃。本研究从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选到了具有脲酶酶活特性的克隆。

【目的】研究奶牛瘤胃内参与蛋白质降解过程中二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidasesⅣ,DPP-Ⅳ)的序列特征和酶学性质。【方法】从奶牛瘤胃微生物Fosmid文库中挑选17 664个克隆,利用dpp-Ⅳ简并引物筛选含dpp-Ⅳ的阳性克隆。提取阳性克隆的质粒,用限制性内切酶HindⅢ进行酶切。PCR扩增含dpp-Ⅳ目的片段,并克隆测序。对阳性克隆的Fosmid末端进行测序。提取阳性克隆粗酶液,利用底物Gly-Pro-pNA检测肽酶活性。【结果】筛选后获得10个含有dpp-Ⅳ的阳性克隆(命名为DP1—DP10)。Fosmid末端序列经BLASTX比对后发现78%的序列可以与数据库的已...

【目的】研究利用茶皂素和丝兰皂苷混合物对瘤胃发酵和瘤胃内纤维降解菌变化的影响。【方法】采用2×4因子体外培养试验设计,因子一为对照组(不添加皂苷)和添加皂苷组(添加0.3%茶皂素和0.03%丝兰皂苷的混合物),因子二为不同精粗比水平(20﹕80、40﹕60、50﹕50及60﹕40),研究不同精粗比以及皂苷条件下对瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响。【结果】茶皂素和丝兰皂苷的混合物能降低瘤胃pH,且精粗比为20﹕80时差异极显著(P<0.01);能够增加乙酸、丙酸、丁酸以及TVFA的浓度,但从各成分所占比例来看,茶皂素和丝兰皂苷混合物的添加降低了乙酸和丁酸的摩尔百分比例,增加了丙酸的摩尔百分比例,因此降...

【目的】探讨日粮中非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维(NFC/NDF)比对山羊瘤胃发酵、瘤胃细菌与瘤胃产乳酸菌菌群结构组成,以及瘤胃产乳酸菌、总细菌与大肠杆菌数量的影响。【方法】试验选用4只装有永久性瘤胃瘘管、健康阉割的长江珠三角白山羊,采用自身对照试验设计,共分3期进行,每期15 d,依次饲喂NFC/NDF比值分别为0.42(Ⅰ期)、1.04(Ⅱ期)、2.73(Ⅲ期)的3期日粮,分别于第13、14和15天采集瘤胃内容物。采用PCR/DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)分析瘤胃微生物区系结构,采用real-time PCR定量瘤胃内容物中总菌...

为研究日粮粗蛋白质水平(crude protein, CP)对育肥湖羊瘤胃微生物、pH及VFA含量的影响,选取54只4月龄[(32.25±2.50) kg]湖羊公羔,采用完全随机分组设计,将试验羊分为3个处理组,每个处理组18个重复,每个重复1只羊,3个处理组日粮CP水平分别为11.5%、14.0%、16.5%,试验期共70 d,包括7 d预试期,63 d正试期。试验期结束后,每组选择10只试验羊进行屠宰,测定屠宰性能并采集瘤胃内容物,用于瘤胃微生物DNA提取。结果表明:1)不同CP处理组对宰前活重、胴体重、屠宰率、瘤胃总重、瘤胃组织重及尾脂重无显著影响(P> 0.05)。2) 11.5%CP组瘤胃液氨态氮显著低于14.0%CP及16.5%CP组(P 0.05)。瘤胃液p H随日粮蛋白水平的增加有增加的趋势(P 0.05),其中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸比例均不受CP水平的影响(P>0.05),但异戊酸的比例随日粮中CP水平的增加有增加趋势(P=0.098)。4)在不同CP处理组中,瘤胃内溶纤维丁酸弧菌含量最高,但各处理组间无显著差异(P> 0.05),其中白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、普雷沃氏菌的含量均不受CP水平的影响(P> 0.05),而黄色瘤胃球菌11.5%CP组显著低于14.0%CP组(P <0.05),16.5%CP组与11.5%CP组及14.0%CP组无显著差异。综上所述,日粮不同CP水平不影响试验羊屠宰性能,但能够影响瘤胃液pH及氨态氮含量,随CP水平的增加,异戊酸的比例有增加的趋势,14.0%CP组黄色瘤胃球菌数最多。

选用普通尿素、包被尿素和大豆分离蛋白为氮源,以蒸汽压片玉米为主要碳源,配制等氮日粮,利用人工瘤胃双外流连续培养系统,研究包被尿素在基于蒸汽压片玉米日粮条件下对瘤胃发酵和微生物蛋白合成的影响。结果表明:大豆分离蛋白组的干物质(DM)和有机物(OM)消化率最高,普通尿素组最低(P=0.02),包被尿素组居中。普通尿素组的氨态氮NH3-N质量浓度最高(1.99 mg/dL),相比之下,包被尿素组的NH3-N质量浓度降低了30.2%(1.39 mg/dL),但仍然高于大豆分离蛋白组(1.04 mg/dL,P

【目的】鉴定新的家蚕蛋白酶抑制剂,探讨其在抵御病原微生物入侵方面的功能。【方法】对家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI37进行T-A克隆、多序列比对、系统发育树构建、原核表达、RT-PCR时空表达特征及微生物诱导分析。【结果】克隆、表达了1个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂,命名为BmSPI37。时空表达特征分析表明,BmSPI37在家蚕5龄幼虫后期表达量很高,而且在中部丝腺中高量表达;在蛹向蛾的变态发育时期,BmSPI37在雌蚕中的表达量显著高于雄蚕。微生物诱导试验表明,BmSPI37在大肠杆菌、黑胸败血菌、球孢白僵菌感染后,强烈上调表达。【结论】推测BmSPI37与防御病原微生物入侵有关。

以蛋氨酸作为惟一氮源和碳源,设添加L-蛋氨酸(M et)组(试验组)和不添加L-蛋氨酸组(对照组),在体外培养条件下研究了这2组的瘤胃微生物谷草转氨酶(A ST)和谷丙转氨酶(ALT)活性及各氨基酸含量的变化规律。结果表明,添加M et对A ST和ALT活性无明显影响,添加M et后产物中游离甘氨酸(G ly)含量和蛋氨酸(M et)含量较对照极显著增加,培养液中游离半胱氨酸(Cys-s)和丝氨酸(Ser)含量随培养时间的增加而减少(P

选择120只(2.5±0.2)胎次、体质量(54.84±4.21) kg、泌乳日龄(72.0±3.5) d的健康西农萨能奶山羊，饲养42 d后，收集奶样，测定羊奶中体细胞数(SCC)，按照SCC将奶山羊分为3组，即L–SCC组(SCC＜50万个/mL)；M–SCC组(50万≤SCC＜100万个/mL)；H–SCC组(SCC≥100万个/mL)，从每组随机选取15只奶山羊，收集瘤胃液，测定其瘤胃微生物多样性，分析羊奶体细胞数与瘤胃微生物的相关性。结果表明：1) 不同SCC水平奶山羊瘤胃微生物的α多样性、β多样性和优势菌群的差异不显著。在门水平上，L–SCC组放线菌门(Actinobacteriota)显著高于M–SCC组和H–SCC组的，浮游菌门(Planctomycetota)显著高于M–SCC组的。在属水平上，主要的差异菌有解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)、普氏菌UCG–003属(Prevotellaceae＿UCG–003)、厌氧弧菌属(Anaerovibrio)、Gastranaerophilales＿unclassified、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、p–251–o5＿unclassified、大肠杆菌–志贺菌属(Escherichia–Shigella)、夏普氏菌属(Sharpea)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)。2)羊奶SCC与解琥珀酸菌属呈显著正相关，与普氏菌UCG–003属呈极显著正相关。综上，不同SCC奶山羊的瘤胃微生物区系有差异，其主要差异菌属为解琥珀酸菌属和普氏菌UCG–003属，羊奶体细胞数与瘤胃微生物菌属呈极显著正相关。

选择120只(2.5±0.2)胎次、体质量(54.84±4.21) kg、泌乳日龄(72.0±3.5) d的健康西农萨能奶山羊，饲养42 d后，收集奶样，测定羊奶中体细胞数(SCC)，按照SCC将奶山羊分为3组，即L–SCC组(SCC＜50万个/mL)；M–SCC组(50万≤SCC＜100万个/mL)；H–SCC组(SCC≥100万个/mL)，从每组随机选取15只奶山羊，收集瘤胃液，测定其瘤胃微生物多样性，分析羊奶体细胞数与瘤胃微生物的相关性。结果表明：1) 不同SCC水平奶山羊瘤胃微生物的α多样性、β多样性和优势菌群的差异不显著。在门水平上，L–SCC组放线菌门(Actinobacteriota)显著高于M–SCC组和H–SCC组的，浮游菌门(Planctomycetota)显著高于M–SCC组的。在属水平上，主要的差异菌有解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)、普氏菌UCG–003属(Prevotellaceae＿UCG–003)、厌氧弧菌属(Anaerovibrio)、Gastranaerophilales＿unclassified、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、p–251–o5＿unclassified、大肠杆菌–志贺菌属(Escherichia–Shigella)、夏普氏菌属(Sharpea)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)。2)羊奶SCC与解琥珀酸菌属呈显著正相关，与普氏菌UCG–003属呈极显著正相关。综上，不同SCC奶山羊的瘤胃微生物区系有差异，其主要差异菌属为解琥珀酸菌属和普氏菌UCG–003属，羊奶体细胞数与瘤胃微生物菌属呈极显著正相关。

从南极获得的260株低温细菌中筛选到107株具有蛋白酶活性菌株,其中5株菌所产蛋白酶的活性高于45U/mL。对其进行16SrRNA基因序列的同源性和系统发育分析,结果表明,菌株NJ276、NJ59、NJ1670、NJ345属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas),NJ341属于科尔韦尔氏属(Colwellia)。对其中NJ276、NJ341、NJ1670、NJ345这4株产蛋白酶南极嗜冷菌的生长及分泌蛋白酶的部分酶活特性进行研究,结果表明:(1)4株菌最适生长、产酶温度均为10℃左右;培养2～5d,嗜冷菌生长、产酶量一直处于较高的状态。(2)4株南极嗜冷菌分泌的蛋白酶的酶活反应...

[目的]青蒿素是天然青蒿属植物的提取物,它很早就在中国传统中药中被用作抗疟疾、抗肿瘤和驱虫等药物。为探讨青蒿素对反刍动物瘤胃发酵、瘤胃内环境及其瘤胃微生物蛋白质循环的影响,确定青蒿素的对瘤胃发酵调控的效果和适宜添加量,为青蒿素作为一种新的瘤胃调控剂在反刍动物生产中应用提供依据。[方法]采用4只带有瘤胃瘘管的徐淮白山羊为试验动物,饲喂以玉米、豆粕和羊草为主组成的基础日粮,在基础日粮中分别添加占日粮干物质0,0.2%,0.4%和0.6%的青蒿素,进行4×4拉丁方设计试验,研究对山羊瘤胃发酵参数、瘤胃微生物种群变化;采用DTAF荧光染料标记细菌(FLB)的一种新方法测定瘤胃原虫吞噬细菌速率和吞噬量的...