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[期刊] 中国农业科学
[作者]
柴阿丽 韩云 武军 石延霞 谢学文 李宝聚
【目的】茄病镰刀菌(Fusarium solani)孢子活性的检测是病害有效防控的基础。传统的孢子萌发法操作复杂,耗时费力,需要建立一种简便、快速的孢子活性检测方法。研究旨在建立基于荧光素二乙酸酯(fluorescein diacetate,FDA)-碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光复染法和流式细胞术(flow cytometry,FCM)的茄病镰刀菌孢子活性检测技术。【方法】通过测定FDA和PI的最佳染色时间和最佳工作浓度,建立茄病镰刀菌孢子活性检测的FDA-PI复染法。为评价该方法的准确性,一方面用FDA-PI法检测已知死孢子比例(0、25%、50%、75%、100...
[期刊] 华北农学报
[作者]
严蕾艳 张宴瑜 马凯慧 宋慧 王毓洪
为了更快更准确地在病菌潜伏期或发病初期鉴定出尖孢镰刀菌引起的瓜类枯萎病和茄病镰刀菌引起的瓜类根腐病这2种病害,根据尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的翻译延长因子TEF1-α序列设计了3条种特异性引物。引物对FO-F和Fu-R可以从尖孢镰刀菌中扩增到1条228 bp的片段,引物对FS-F和Fu-R可以从茄病镰刀菌中扩增到1条347 bp片段,并且3条引物FO-F、FS-F和Fu-R可以同时在1个PCR反应中扩增到2个片段,而这2对引物都不能从其他病原真菌中扩增到任何条带。结果表明,该多重PCR检测方法可以同时鉴定样品中的2种镰刀菌。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李欣 崔秀明 刘迪秋 孙恬 郭爱玲 陈军
为了建立一种准确、快速检测三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR方法,基于尖孢镰刀菌脂肪酸ω-羟化酶基因设计了实时荧光定量PCR的特异性引物对Fo-QF和Fo-QR,制备了该基因的重组质粒标准品,建立了尖孢镰刀菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。从三七种植区采集到14个具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株及三七种植土壤样品,并提取了这些样品的总DNA,运用本研究建立的荧光定量PCR方法进行了检测。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法特异性强,脂肪酸ω-羟化酶基因只以尖孢镰刀菌DNA为模板扩增出特异的PCR产物。此外,该方法灵敏度高,检测模板浓度可低至0. 35 pg/μL。构建的荧光定量PCR标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,扩增效率好。利用该定量检测体系,能从几种不同的三七病株中快速检测出携带尖孢镰刀菌的根腐病病株,从而达到准确诊断的目的。本方法不仅能明确三七种植土壤以及三七病株中尖孢镰刀菌数量的动态变化,并且可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及带病三七种子、种苗的快速分子检测提供技术支持。
[期刊] 草业科学
[作者]
朱倩丽 赵官涛 王露 何翔 张洋洋 王常清 聂江山 陈秀蓉
禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是真菌性玉米茎基腐病的主要致病菌之一,为了减少种子带菌对该病害的传播,本研究采用巢式PCR技术构建玉米种子检测体系,并对其进行特异性、灵敏度和可行性检测。结果表明,该体系可有效检测到玉米(Zea mays)种子携带禾谷镰刀菌的情况,灵敏度达4.224 pg·μL-1,是一种快速、灵敏、特异性强的检测体系,为玉米茎基腐病种子带菌检测、早期诊断和及时防治提供技术支持和理论依据。本研究是运用巢式PCR技术检测玉米茎基腐病主要致病菌-禾谷镰刀菌在国内的首次报道。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
蒋荷 郑慧慧 曹莎 吴学宏 黄俊生
为检测黄瓜种传镰刀菌产生的粗毒素中镰刀菌酸含量及其对种子和幼苗的致害作用,采用乙酸乙酯和乙醚萃取法提取其中的镰刀菌酸并利用HPLC法进行定量分析,通过粗毒素处理黄瓜种子及幼苗根部测定其对种子发芽的影响和幼苗的致枯萎作用。结果表明:供试7株种传镰刀菌SC-CQ-P、HLJ-XC-S、LN-ZN203-S、GD-HY-S、HN-XH-S、LN-ZN6-S和HB-TS-R粗毒素中都检测到镰刀菌酸,质量浓度分别为3 574.71、866.43、291.10、123.32、856.13、358.27和327.71μg/mL。种传镰刀菌粗毒素对黄瓜种子发芽具有一定的抑制作用;粗毒素浸渍黄瓜幼苗根部导致幼苗...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
董文盼 杨纪潇 杨项明 吕明慧 朱彦泽 蒋春号
[目的]本文构建了西瓜枯萎病菌—尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，FON）的重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification， RPA）的快速检测体系，以期为田间西瓜枯萎病的快速检测提供技术支持。[方法]从NCBI网站下载包括西瓜枯萎病菌在内的11种病原真菌的基因组序列，利用SeqHunter2软件进行生物信息学分析，经比对得到4个FON的特异性基因片段，并对其进行引物设计和筛选。利用聚合酶链式反应（PCR）验证引物的特异性和灵敏度，而后利用建立的RPA检测体系对引物的特异性和灵敏度进行验证，最后进行人工接种FON的西瓜植株的RPA检测与评价。[结果]本文首次报道了FON的RPA检测体系，并对DNA恒温快速扩增试剂盒的扩增体系进行最佳反应时间（40 min）和最适反应温度（30℃）的摸索，得到其最佳反应体系的检测下限为100 pg/μL。利用DNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）进行扩增时，只需在38℃反应12 min，取50 μL稀释20倍的扩增产物用胶体金试纸条进行检测，5 min后即可进行结果的判断，检测下限为100 pg/μL。[结论]本文通过多种检测方法对RPA扩增结果进行检测，均得到一致的结果，且建立的RPA检测体系能够从温室接种FON之后未显症的西瓜植物组织基因组DNA中检测到FON，可为田间西瓜枯萎病早期的快速检测提供技术支持。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李启新 杜琦 陈长法 李祥
以棉枯萎镰刀菌公安菌株为材料,用物理法和化学法提取抗原并制备抗血清,并选有代表性的抗血清对其特异性和灵敏度分别采用4种检测方法进行了检测比较研究。结果表明:(1)采用 Richard’s培养基振荡培养菌株,化学法提取菌丝孢子抗原,按改进的 J.E.Devay 设计的免疫方案免疫,能产生效价高达1:64的抗血清。(2)琼扩、比较对流免疫电泳、间接 ELISA,SPA-ELISA 等4种方法检测其特异性具有鉴别到尖孢镰刀菌种的水平的特异性,但不能鉴别专化型和生理小种。并用上述方法检测抗血清灵敏度。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
林艳秋 彭江涛 官华忠 侯新坡 陈志伟 朱秀凤 黄荣德 周元昌
利用分别与抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-9紧密连锁的SSR标记MRG4766和SNP标记FP1+FP2+RP组成双重PCR体系,通过设置Mg2+、d NTPs和引物浓度梯度,探索双重PCR体系中各反应物的使用量,由此确定最优双重PCR反应体系.在水稻恢复系R1059与R673杂交的BC3F2群体中随机挑选20个单株对该双重PCR反应体系的效果进行验证.结果表明,20个单株的双重PCR扩增结果与2个单一PCR扩增结果相符,并且条带清晰,说明该双重PCR反应体系在利用分子标记进行基因聚合上可提高选择效率和减少费用.
关键词：
双重PCR 反应剂浓度 扩增效果
[期刊] 华中农业大学学报(自然科学版)
[作者]
肖青 李永杰 汪健康 查兴平 黄建明 何张江 康冀川
为探究内生真菌砖红镰刀菌在番茄生长及抗病过程中的作用,使用1×107CFU/mL砖红镰刀菌芽生孢子悬液浸根处理发芽的番茄,结果显示:处理50 d后番茄株高较对照组增加了1.15倍;叶绿素a、叶绿素b含量较对照组分别增加1.16倍和1.47倍;根系生物量较对照增加1.38倍;砖红镰刀菌处理组对番茄枯萎病的病情指数(45.16%)较对照组(74.15%)下降;浸根处理20 d时植物生长素合成关键基因SlYUC5、水杨酸合成关键基因SlICS1表达水平与未处理对照组相比无显著差异;处理30及40 d后,SlYUC5表达水平较对照组相比表达显著上升,SlICS1表达水平较对照组显著降低;茉莉酸合成途径关键基因SlLOXD在20 d时表达水平较对照组显著下调38.73%(P
关键词：
内生真菌 砖红镰刀菌 番茄 促生 抗病
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵玮琦 何朋杰 吴毅歆 何月秋
【目的】十字花科作物根肿病是一种世界性病害,早期准确定量检测病原是实现有效防控的基础,研究旨在建立一种应用于水体中检测根肿菌的实时荧光定量PCR方法。【方法】采用近年已研究并发表的一对引物。建立并优化RT-PCR反应体系,利用大肠杆菌TG-1、大肠杆菌T1-1、大肠杆菌DH5α、肺炎克雷伯菌E3、枯草芽孢杆菌XF-1、解淀粉芽孢杆菌Y2、柑橘黄龙病病原菌、假单胞菌E12、成团泛菌L9、阴沟肠杆菌C6、荧光假单胞菌df等11种病原物进行RT-PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测不同接种浓度的水体中的根肿菌。【结果】得出标准曲线的回归方程为Y=-3. 452X+35. 118,其回归系数R2=0. 996,扩增曲线在1×101～1×107拷贝/μl范围内,具有较好的线性关系,扩增效率94. 833%,相邻扩增曲线间距均匀,1×101拷贝/μl为最低检测值。熔解曲线显示,所有产物具有单一峰形,有高度扩增特异性。重复性试验变异系数小于1%。在人工接种的水体中,检测下限至少为102个孢子/m L。【结论】建立的实时荧光定量PCR方法具有快速、特异、敏感和稳定等优点,为检测根肿菌在水体中的含量提供了技术方法。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
宋琼 任佐华 杨华 刘二明
为准确、快速、便捷检测出土壤中根肿病菌休眠孢子量,应用所建立的根肿病菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测技术,测定了湖南湘潭县响水乡、长沙县路口镇、桃江县桃花江镇十字花科作物根肿病发生地的42份土样的休眠孢子数量。检测结果表明,40份土样的根肿病菌休眠孢子量为(2.76×104~4.37×106)个/g;休眠孢子量≥104个/g的土壤均有根肿病发生,而休眠孢子量为8.42×102、9.78×102个/g的2份土样未发生根肿病,说明当土壤中根肿病菌休眠孢子量≥104个/g时,根肿病害易发生。
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
朱致翔 时浩杰 雷飞斌 张传清
由茶麋子葡萄座腔菌Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ引起的山核桃Ｃａｒｙａ Ｃａｔｈａｙｅｎｓｉｓ干腐病是山核桃栽培过程中的主要病害，该病菌表现明显的＂潜伏侵染＂特性。研究山核桃树体中干腐病菌的定量检测技术对山核桃干腐病的预测预报及科学防治具有重要的指导意义。根据茶麋子葡萄座腔菌的ｅＦ１α基因设计特异性引物，通过普通聚合酶链式反应（ｐＣｒ）和实时荧光定量ｐＣｒ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐＣｒ）扩增发现引物ｅＦｒｔ－Ｆ１／ｒ１对山核桃干腐病病菌的特异性及扩增效率较高，可稳定扩增出２３０ Ｂｐ的目标条带。应用此特异性引物建立的实时荧光定量ｐＣｒ干腐病病菌检测方法能够定量检测出山核桃植株样品．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王念武 王婷 沈建国 胡方平
【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,CMM),一直以来都受检测周期的限制,快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增方式,并结合实时荧光PCR技术,旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法,为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列,设计锁式探针的T1和T2臂,使之与CMM的特异性片段碱基序列互补,再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时,先...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李华 祭芳 徐剑宏 王裕中 史建荣
【目的】建立快速、灵敏、有效的毒素检测方法,以保证麦类作物的安全生产以及谷物食品的安全性。【方法】以主要赤霉病菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)为对象,利用半琥珀酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇的牛血清蛋白偶联物(3-HS-DON-BSA)作免疫原,分别采用腹膜腔注射法和颈、背部多点注射法免疫Balb/c小鼠和豚鼠,获得DON的多抗血清,建立间接ELISA检测方法。【结果】多抗豚鼠血清的效价达到1∶6400,而小鼠混合血清的效价则为1∶12800。引起DON抗体最大结合50%抑制时,所需DON及其类似物3-Ac-DON和T-2毒素的量分别为63μg·ml-1、114μg·ml-1和>1000μg·ml-...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
孟佳佳 郭文博 聂冬霞 韦阳 赵志辉 韩铮
[目的]脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是农产品中广泛存在的一种重要真菌毒素，给人和动物带来了较大的安全风险。目前关于DON标准物质的研究主要集中在溶液标准物质和成分分析标准物质上，未见DON有证纯度标准物质的报道。本项目拟研制DON国家级纯度标准物质，为农产品中DON的检测等工作提供物质基础。[方法]利用质量平衡法和定量核磁法两种不同原理的方法对DON纯度标准物质进行纯度定值。质量平衡法包括利用液相色谱面积归一化法进行DON主成分含量测定，卡尔费休库仑法进行纯度标准物质中水分含量的测定，顶空气相色谱-质谱法进行挥发性杂质含量的测定，电感耦合等离子质谱法进行无机离子杂质含量测定。定量核磁法采用苯甲酸为内标，选择合适的共振峰，内标法定量标准物质的纯度。并对标准物质进行了均匀性、稳定性检测和不确定度评估。[结果]质量平衡法的纯度定值结果为99.47%，定量核磁法定值结果为99.45%，最终所研制的DON纯度标准物质的纯度为99.5%，扩展不确定度为0.4%，均匀性良好，且满足12个月以上的稳定性要求。[结论]研制的DON纯度标准物质符合国家标准物质技术规范，目前已被批准为国家一级标准物质，并已被用于小麦、玉米等农产品的实际检测过程。
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