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[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐重新 金嘉凤 孙晓明 沈成 张霄 陈澄宇 刘贤金 刘媛
Bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白，其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治，产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕Bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点，特别是随着Bt毒素结构功能和作用机制日趋明晰，为其功能修饰和创新应用创造了条件，相关研究蓬勃发展，成效显著。大量研究表明，采用定点突变、结构域替换或融合以及抗独特型抗体模拟等策略，是理性设计活性更高、稳定性更强、杀虫谱更广、非靶标生物安全性更高甚至是可用于害虫抗药性治理的有别于母体Bt毒素的突变体、结构杂合体乃至功能效应物抗体等新型杀虫蛋白的有效手段；此外，采用催化毒素活化、驱动毒素靶向受体结合、促进毒素表达以及同源或异源杀虫材料复配或共表达的协同促效等创新增效策略，也是助推Bt毒素应用价值的重要手段。本文总结了Bt毒素结构功能和作用机制，梳理了基于Bt毒素功能修饰的突变体、结构杂合体以及功能效应物抗体等新型杀虫蛋白理性设计和基于Bt毒素功能增效的创新应用策略等相关研究进展，并结合作者团队在模拟Bt毒素杀虫功能效应物抗体靶向设计研发方面的最新成果，探讨了基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略未来发展动向及潜在可行捷径，为相关研究提供较为全面的最新有价值的文献资料和启发思路。
[期刊] 华北农学报
[作者]
吴瑞华 李国勋 冯书亮 王容燕 王金耀 曹伟平 杜立新 陈丹
苏云金杆菌是目前应用较广泛的生物杀虫细菌之一,其产生的杀虫蛋白毒素是主要的杀虫成分,目前对苏云金杆菌的毒力和杀虫蛋白毒素的检测主要采用生物测定、SDS-PAGE等方法,但这些方法的灵敏度较差。本文综述了酶联免疫吸附分析法在苏云金杆菌蛋白毒素检测中的应用,以及在检测中采用的ELISA的类型和基本原理,并对其应用前景进行了展望。
[期刊] 华北农学报
[作者]
安世恒 郭线茹 罗梅浩 蒋金炜 马继盛
利用RT-PCR技术扩增烟夜蛾(HelicoverpaassultaGuen啨e)幼虫中肠Bt毒素Cry1Ac受体蛋白APN(N-氨基肽酶,aminopeptidaseN,APN)基因片段,克隆和测序结果表明,测序得到的812bp的片段编码270个氨基酸残基,且该片段在阅读框内。通过同源性分析发现,其核苷酸序列与棉铃虫(H.armigera)、澳洲棉铃虫(H.punctiger a)、烟芽夜蛾(H.virescens)、舞毒蛾(Lymantriadispar)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、印度谷螟(Plodiainterpunctella)RC688品系和HD198品系、烟...
关键词：
烟夜蛾 Bt 受体蛋白 cDNA 克隆
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周慧敏 牛家峰 池慧兵 马斌 朱萍 陆兆新 吕凤霞
[目的]呕吐毒素（DON）广泛存在于粮谷类原料及其制品中，对人和动物的健康都造成严重危害。然而，现有呕吐毒素解毒酶存在种类少、催化性能差等问题，限制了其在食品加工和饲料中的应用。本研究采用理性设计策略对呕吐毒素解毒酶DepB进行分子改造，以提高DepB的催化活性。[方法]通过对底物10 ?范围内的氨基酸残基进行丙氨酸和甘氨酸扫描，确定突变“热点”氨基酸残基。随后，采用定点饱和突变和组合突变技术筛选得到催化活性显著提高的突变酶，并对其进行三维结构模拟和分子动力学模拟，分析其催化活性提高的分子机制。[结果]获得了催化活性显著提高的三点突变酶A289V/A227R/S54N，该酶比活力为335.77 U·mg~(-1)，是野生型DepB的2.25倍。动力学参数显示，三点突变酶的K_(m)值由95.11 μmol·L~(-1)下降到58.33 μmol·L~(-1)，k_(cat)/K_(m)比值由5.99 mmol~(-1)·L·s~(-1)提高至16.94 mmol~(-1)·L·s~(-1)，亲和力和催化效率均显著提高。通过三维结构模拟和分子动力学模拟分析，发现空间位阻减小、静电相互作用增强、酶-底物-辅酶结合自由能降低是其催化活性提高的分子机制。[结论]基于理性设计策略提高了DepB的催化活性，强化了DepB的适用性能，为呕吐毒素解毒酶的分子改造及其在食品加工和饲料中的应用提供依据。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘兴龙 程林友 李天龙 李长友 李国勋
根据已知Btcry8类基因的全长序列设计一对特异性引物JJX5和JJX3,以Bt菌株B-DLL的质粒DNA为模板扩增出3.5 kb大小的片段;将该片段插入大肠杆菌表达载体pET-21b中,并完成了该片段的全序列测定。该基因编码区为3 495 bp,编码的蛋白质由1 164个氨基酸残基组成,相对分子质量为131.8 kDa,等电点为pH 4.71,为弱酸性蛋白。该基因(GenBank:EU047597)编码的氨基酸序列与Cry8Ea1的氨基酸序列同源性高达99.31%,被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry8Ea2。经IPTG诱导后该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达130 kDa...
[期刊] 华北农学报
[作者]
初立良 郑桂玲 周洪旭 李长友 李国勋
发掘对鞘翅目害虫具有活性的苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株和杀虫蛋白基因在生物防治中日益受到人们的重视。利用杀鞘翅目Bt基因通用引物进行PCR检测与生物测定相结合的方法,从山东省各地土壤中分离的66株Bt中筛选获得了两株对鞘翅目昆虫具有杀虫活性的菌株B-DLL和B-JJX,并采用SDS-PAGE和PCR-RFLP方法对其杀虫晶体蛋白和杀虫基因类型进行了鉴定。结果表明,菌株B-DLL和B-JJX对华北大黑鳃金龟1龄幼虫14 d的校正死亡率分别为86.7%和60.0%,对暗黑鳃金龟1龄幼虫14 d的校正死亡率分别为83.3%和76.7%,对柳蓝叶甲3龄幼虫5 d的校正死亡率分别为33.3%和46.7%。...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
胡建军 刘庆一 王克胜 张宝恩 田颖川 韩一凡
近几年，基因工程发展很快，通过基因工程已获得了各种各样的转基因植物，如抗虫转基因农作物的棉花（ＧｏｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ．）、水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）、马铃薯（ＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍＬ．）、玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）、小麦...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
赖云松 王亚 涂巨民
苏云金芽胞杆菌在其整个生命周期中可产生2种不同类型的专一性极强的杀虫蛋白,一种是在其产孢过程中形成的杀虫晶体蛋白(ICPs),包括晶体毒素(Cry)和细胞裂解毒素(Cyt),前者对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、鳞翅目和双翅目或鳞翅目和鞘翅目以及线虫具有专一的杀虫活性,后者在体外具广泛的溶细胞活性,但其杀虫谱较窄,杀虫活性较低;另一种是在营养生长期合成并分泌到胞外的非晶体杀虫蛋白即营养期杀虫蛋白(VIPs),具有与杀虫晶体蛋白相似的毒性活性和专一性。然而,这3种蛋白的分子结构和毒性机理各不相同。本文综述了ICP蛋白和VIP蛋白的杀虫机理和害虫抗性产生的分子基础,以及营养期杀虫蛋白的发现和应用对延缓或防...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
邢珍娟 王振营 何康来 白树雄
【目的】研究间苗后留在田间地表的转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解规律,比较两种Bt玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定各取样时期中幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白残留量。【结果】转Bt基因玉米幼苗残体中杀虫蛋白降解是逐渐的,且降解速度较快,到50d时幼苗残体已经完全腐烂,Bt11幼苗残体中的杀虫蛋白已经完全降解,在MON810中还能检测到微量的杀虫蛋白。两种转基因玉米幼苗残体中的Bt杀虫蛋白的初始含量差异不显著,但在同一时间段的Bt杀虫蛋白降解速度存在差异均显...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李云河 张永军 吴孔明 原国辉 郭予元
采用ELISA 方法研究了Bt 棉花叶片中Cry1Ac 杀虫蛋白在不同环境条件空气介质中和土壤介质中的降解规律。结果表明,不同环境下Bt 杀虫蛋白降解趋势有明显差异。不同温湿度及光照条件的空气介质中,Bt 杀虫蛋白的降解速度一般在初期较快,经过短暂的缓慢降解阶段后进入相对稳定状态(含量50 ng·g-1左右)。高温低湿条件下,Bt 杀虫蛋白降解较快,达到稳定水平的时间短。Bt 杀虫蛋白在光照和非光照环境下的的降解动态没有显著性差异。自然条件下Cry1Ac 蛋白在土壤介质中初始阶段降解迅速,30 d 后降解了85%左右。随着冬季的到来,杀虫蛋白降解趋于缓慢。次年春天后,杀虫蛋白的降解加快,至4 ...
关键词：
转Bt基因棉花 Bt杀虫蛋白 降解动态
[期刊] 中国农业科学
[作者]
白耀宇 蒋明星 程家安
目的研究转Bt基因水稻表达的外源Bt杀虫蛋白在土壤中的环境去向,以便进行转BT基因水稻的生态风险性评价。方法室内采用ELISA法,研究转Bt基因水稻克螟稻2号(KMD2)粉碎叶片中Cry1Ab杀虫蛋白在3种水稻土,即青紫泥田、黄筋泥田和黄松田土中不同土壤含水量、土壤pH值和温度条件下的降解动态。结果供试叶片粉中Cry1Ab蛋白在3种水稻土中的降解动态均可用一级化学反应动力学指数方程来拟合,降解半消减期t0.5为1.8～4.0d。结论土壤含水量、pH和温度对Cry1Ab蛋白降解速率均有一定影响,但pH和温度的影响更为明显。通常pH较低的酸性土壤和低温不利于土壤中Cry1Ab蛋白的降解,特别是在酸...
[期刊] 华北农学报
[作者]
臧大康 郑桂玲 周洪旭 张媛 李国勋 李长友
以本实验室分离的Bt菌株B-DLL质粒DNA为模板,利用cry8类基因特异性引物JJX5和JJX3扩增出3.5kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD 18-T中,筛选获得一个含新基因的克隆pMD-cry8new。序列测定表明,该基因编码区为3 525 bp,编码的蛋白质由1 174个氨基酸残基组成,理论分子量为133.05 kDa,等电点为pH4.69,为弱酸性蛋白。该基因核苷酸序列已在GenBank登录(Accession number:HQ174208),编码的氨基酸序列与Cry8Fa1的同源性最高达99.8%,被国际Btδ-内毒素命名委员会正式命名为Cry8Fa2。将cry8Fa2基因插...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周晓梅 沈晋良 高聪芬
用EnvirologixCry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系 (NUCOTN33B、NUCOTN99B) 以及常规对照品系 (苏棉 12) 不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量。结果表明, 两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势, 花铃期 (NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为 4 43和 2 93μg·g-1 ) 和吐絮期 (3 87和 2 86μg·g-1 ) 的含量分别降至苗期第 6叶 (7 64和 8 38μg·g-1 )的 58%、35%和 51%、34%; 相同时...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
丁双阳 何钟佩 王保民
在离体培养条件下,研究了外源 Bt 杀虫晶体蛋白对棉花胚珠内源激素系统变化及发育过程的影响,结果表明,外源 Bt 杀虫晶体蛋白明显影响胚珠发育的进程,内源 CTKs,GAs,ABA 含量下降,IAA 含量增加,胚珠总糖含量增加,可溶性蛋白含量降低,最终胚珠干重显著降低。0～200ng/mL 范围内,随外源Bt 杀虫晶体蛋白浓度增加,对胚珠发育的影响增大。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张祥 胡大鹏 李远 张丽雅 王剑 陈源 陈德华
【目的】研究土壤水分亏缺对Bt棉杀虫蛋白含量及Bt基因表达、氮代谢酶活性的影响,为Bt棉抗虫性安全表达提供理论参考。【方法】2014—2015年以Bt棉常规品种泗抗1号、杂交种泗抗3号为材料,采用盆栽法,2014年设置5个土壤水分处理:G1、G2、G3、G4和CK,其土壤含水量分别为最大持水量的15%、30%、45%和75%。2015年设置4个处理:G2、G3、G4和CK。观察土壤水分亏缺对盛铃期Bt棉铃壳杀虫蛋白含量影响。所有处理于盛花期前10 d控制浇水,如遇下雨,将处理盆钵移入室内。使用WET土壤三
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