【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,CMM),一直以来都受检测周期的限制,快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增方式,并结合实时荧光PCR技术,旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法,为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列,设计锁式探针的T1和T2臂,使之与CMM的特异性片段碱基序列互补,再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时,先...

为快速检测番茄种子表面的带菌情况,以便及时有效防控番茄溃疡病,从而减少病害损失。试验用细菌基因组DNA试剂盒提取番茄溃疡病的总基因组,用通用引物进行PCR反应。以番茄溃疡病菌的DNA为模板,使用专一性引物进行PCR扩增,通过对专一性引物的筛选,最终确定了Cla F1-Cla F2为快速检测番茄溃疡病菌PCR的特异性引物。该检测方法特异性强、灵敏度高,模拟种子带菌,对浸种水的检测灵敏度达1×105CFU/m L。经PCR快速检测,22个番茄品种中只有黑贝番茄、粉红番茄和保罗塔带有番茄溃疡病菌,其余19个品种均未带菌。该方法直接对种子进行检测,不需进行病原菌分离培养,快速简便。

为了筛选出对番茄溃疡病菌有拮抗作用的内生细菌,从健康番茄茎样本中分离得到186株内生细菌。用抑菌圈法测定,其中9株内生细菌对番茄溃疡病菌有拮抗作用。通过形态特征观察、生理生化特性测定和16 S rDNA序列分析,对拮抗作用较强的7个菌株进行了鉴定。结果表明,BM-31、BT-10、BT-9、BT-7、BT-3为微杆菌(Microbacteriumspp.),QB-22和QB-8为假单胞菌(Pseudomonasspp.)。

选取不同浓度的柑橘溃疡病菌SOB培养液,利用载玻片进行固定、封闭、抗体结合、免疫荧光标记及荧光强度检测,以探讨免疫荧光检测技术在柑橘溃疡病菌快速检测方面的应用。结果表明,30℃下用BSA封闭2h,30℃下抗体结合1 h,荧光抗体浓度为4μg/mL,室温放置40 m in后,在荧光显微镜下可以清楚看到绿色的柑橘溃疡病菌体。该方法操作简便,检测过程仅需4 h,抗原抗体反应特异性极强,检测灵敏度可达103cfu/mL。

Fusarium circinatum, the causal agent of pitch canker disease, causes several serious diseases of pines. The pathogen infects a variety of vegetative and reproductive pine structures at different stages of maturity and produces a diversity of symptoms. Long distance spread of the disease occurs when...

利用微波热震惊提取固体表面柑桔溃疡病基因组DNA并加以优化,所得到的基因组DNA可作为PCR反应的模板进行16SrDNA基因有效扩增。与柑桔溃疡病基因组DNA其他抽提方法相比较,微波法更适用于该病的快速检测,具有快速、简便、费用低廉等特点,且对设备的要求不高,用特异性引物XCF/XCR可实现柑桔溃疡病菌的快速鉴定。

【目的】建立一种实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)的方法,用于测定田间植株样品及其传毒媒介烟粉虱(Bemesia tabaci)中To CV的含量。【方法】首先根据To CV次要外壳蛋白(minor coat protein,CPm)基因的保守区域序列,运用Primer 3.0在线软件设计To CV特异性检测引物To CVq F和To CVq R,并通过Primer-BLAST进行比对保证检测引物的特异性;其次分别以感染To CV、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的番茄样品为模板,应用该对引物进行To CV基因片段的克隆鉴定;将阳性克隆样品放入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中扩大培养,并提取质粒,获得To CV质粒标准品,将To CV质粒标准品按10倍浓度梯度稀释,建立标准曲线;同样以按10倍浓度梯度稀释的To CV质粒标准品为模板,同时运用RT-q PCR和反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),比较这两种方法检测To CV的灵敏度;最后应用该方法对田间采集的8份疑似To CV感染的番茄样品以及获毒24 h后的单头烟粉虱进行病毒检测,结合扩增曲线、熔解曲线和Ct值对待测样品中的带毒情况和带毒量进行测定。【结果】在感染To CV的番茄样品和阳性对照中,引物To CVq F和To CVq R均能够特异扩增出To CV CPm基因片段,目的片段大小为230 bp,而在感染TYLCV、TSWV的番茄样品、健康番茄样品和空白对照中,该对引物则无法扩增出特异性目的条带,说明该对引物特异性较强;构建To CV的RT-q PCR标准曲线结果表明,随着To CV质粒标准品模板浓度逐渐降低,Ct值出现递增趋势,并且在质粒标准品浓度2.7×103—2.7×109 copies/μL范围内,To CV标准曲线Ct值同质粒标准品浓度之间呈现良好的线性关系,扩增效率为100%,决定系数R2=0.9911,直线方程为y=-3.32×lgx+40.06(y代表循环阈值即Ct值,x代表质粒初始浓度),该曲线将用于To CV含量的测定。RT-q PCR灵敏度检测结果表明,该方法能够检测出的To CV质粒标准品最低浓度为2.7×103 copies/μL,而常规RT-PCR仅能够检测出2.7×105 copies/μL的病毒样品,通过RT-q PCR法检测To CV比常规RT-PCR法灵敏100倍。该方法能成功检测出田间植物样品携带To CV情况,8份疑似To CV感染的番茄样品中有6份携带To CV,同常规RT-PCR检测结果一致,结合标准曲线计算出感染To CV的番茄样品带毒量分别为2.48×105、2.21×105、7.97×104、3.74×107、3.37×107、2.78×106 copies/μL;烟粉虱获毒24 h后,携毒率为100%,单头烟粉虱最高带毒量为2.55×104 copies/μL,最低为6.46×102 copies/μL。【结论】建立的RT-q PCR检测To CV的方法特异性强、灵敏度高,可以实现植物样品和媒介昆虫携带To CV情况和病毒含量的检测,可为To CV的准确、有效监测和预警提供技术支持。

用浓度为１０８ｃｆｕ／ｍｌＸ．ｃ．ｐｖ．ｃｉｔｒｉ全胞活菌免疫家兔，得到效价为１／２５６０～１／１０２４０的抗血清。应用斑点酶联法（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）检测Ｘ．ｃ．ｐｖ．ｃｉｔｒｉ表明，抗血清经交叉吸收后特异性高，适宜稀释倍数为１∶１０４～１０６，检测灵敏度高可达１０４ｃｆｕ／ｍｌ。加有０．５％Ｔｗｅｅｎ２０或０．５％Ｔｗｅｅｎ８０或０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ－１００的ＴＢＳ液为适宜封闭液，酶标抗体以ＨＲＰ－ＳＰＡ较好。在检测无症样品时，与使用酶联板的ＩＭ－ＥＬＩＳＡ、ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ和ＳＰＡ－ＥＬＩＳＡ比较，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ快速简便，整个过程只需６小时，结果可靠。

从加拿大进境油菜籽中随机选取船载油菜籽样品,通过特异引物的PCR扩增检测和病原菌分离鉴定,观察了油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans的发生情况。结果表明:所有来自3艘轮船的15份油菜籽样品的油菜茎基溃疡病菌PCR检测都呈阳性;随机选择的3份阳性样品的病原菌分离、鉴定与致病性测试结果证实了PCR的检测结果。

基因芯片技术因能对生物样本进行快速、高通量的定性和定量分析，而在植物病害诊断中也得到普遍的应用［１］。树木溃疡病是指引起木本植物树皮上出现溃疡腐烂等症状的病害［２］。引起杨树溃疡病的真菌种类较多，加之其无性型和有性型多样，所以，关于杨树溃疡病病原菌的报道多有不同。另外，受地理位置、寄主植物关系及分类体系的限制，迫切需要发展不依赖于常规分离培养的病原鉴定新技术。

[目的]传统的以ITS(内转录间隔区)为靶序列对大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora,DPC)的分子检测无法区分大豆南方茎溃疡病菌(D.phaseolorum var.meridionalis)和大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla)等近似种。笔者在大豆北方茎溃疡病菌靶标序列筛选中,发现了翻译延伸因子(translation elongation factor 1α,tef1α)序列。通过目标病原菌与其相似种比对发现,大豆北方茎溃疡病菌在tef1α序列上有很好的特异性,适合作为分子检测的靶标。[方法]基于环介导等温扩...

利用真菌通用引物ITS1/ITS4,EF1-728F/EF1-986R对4种杨树溃疡病病原菌株和环境样本的核糖体DNA内部转录间隔区ITS序列和转录延伸因子EF-1α基因序列分别进行普通和多重PCR检测,再进行测序比对分析。结果表明:退火温度为55.6℃,各引物终浓度为0.2μmol·L-1,可以成功地扩增出菌株和环境样本的目的条带,并通过测序比对鉴定出多种来自培养和环境病害组织中的溃疡病病菌,多重PCR能够检测到1ng的基因组DNA。研究结果将为建立溃疡病病原多重PCR鉴定技术和以环境溃疡病病害样本为直接检测鉴定对象的高通量的基因芯片检测方法奠定基础。

以松材线虫rDNA -ITS2为靶区 ,建立松材线虫的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。对松材线虫大量DNA和单条线虫的检测结果表明 ,探针检测松材线虫和拟松材线虫时 ,前者产生明显的荧光信号 ,后者无荧光信号 ,表明探针具有高度的特异性 ;探针检测到最低模板浓度为 1pg·μL- 1 ,DNA测序结果与实时荧光PCR结果一致

番茄溃疡病（Bacterial canker of tomato）是目前国内外番茄生产上最严重的细菌病害之一。为建立准确有效的人工接种鉴定体系，本研究采用5种不同的人工接种方式（剪顶法、喷雾法、复叶柄注射法、茎顶端注射法和茎基部注射法）对番茄植株进行接种，比较和分析了接种后各群体植株起始发病时间、平均发病率、病情指数和平均死株率等指标。结果表明：剪顶法和茎部注射法接种病原菌致病效果最好，发病率达到100.0%，病情指数>75.0，但是剪顶法接种后植株死亡率很高，接种40d时死亡率高达96.7%，不利于后续的遗传分析及留种；进一步分析发现茎基部注射接种时病原菌在植株体内传播速度更快；用5份抗感性不同的番茄材料及2个遗传分离群体共计742株番茄进行茎基部注射接种，结果表明该法接种后可以准确区分番茄材料的抗感性。综上所述，本研究结果表明茎基部注射法接种适用于番茄材料抗溃疡病评价及遗传分析，为抗溃疡病番茄材料的筛选及抗性品种的培育提供了有力支撑。