综合制药工程专业实践教学要求和学科前沿方向,设计了"基于酵母杂交的CRISPR/Cas9基因编辑"实验。该实验先采用基因重组技术,分别构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,以及重组酵母yPH1和y PH6-8,再利用酵母杂交平台研究CRISPR/Cas9基因编辑载体的靶向性和脱靶机率。该实验内容包括微生物培养、微生物生长曲线绘制、基因重组技术、基因表达和CRISPR/Cas9基因编辑技术,以及学习Origin作图软件和荧光成像技术。该实验具有综合性、设计性和研究性特点,同时具有材料成本低、过程简化和结果明显的优势,不仅方便学生学习基因编辑原理,掌握基因编辑核心技术,了解脱靶效应的普通性,而且有利于培养学生的创造性思维,提高分析、解决问题的能力。

CRISPR-Cas9是一种现代生命科学研究中普遍使用的新型基因编辑技术。为了升级课程内容体系，使实验教学贴近科研实际，提升实验课程教学质量，南开大学遗传学实验课程组设计了T7核酸内切酶1（T7E1）检测CRISPR-Cas9基因编辑效果实验。以CRISPR-Cas9基因编辑技术对mfn1编辑过的HeLa细胞为实验材料，提取基因组DNA，PCR扩增mfn1基因片段，切胶回收后，变性，退火，使用T7E1对编辑效果进行检测。经1%琼脂糖凝胶电泳，可观察到T7E1将略大于500 bp的mfn1基因片段切成两条大小约为250 bp的DNA片段，表明CRISPR-Cas9成功地对mfn1进行了编辑。

文章以CRISPR/Cas9基因编辑技术为基础，设计了面向非生物专业学生的“利用基因编辑技术建立靶基因敲除细胞系”实验课程。实验包括验证性和探索性内容，整合了生物信息学、分子生物学、细胞生物学、基因工程等多学科知识点，有利于加强学生对相关生命科学知识的理解，有利于提高学生综合实验设计能力和培养创新精神。

油菜是世界第二大油料作物，同时也是我国最主要的食用植物油来源。长期以来，油菜育种工作者尝试通过传统育种策略培育良种。然而，甘蓝型油菜是种间杂交后双二倍进化而来的异源四倍体物种，其基因组中存在较多基因冗余现象。因此，通过人工杂交选择、随机诱变等传统遗传方法改良性状效率非常低。近年来，CRISPR/Cas9技术以其高效、简便的独特优势，已广泛应用于多倍体油菜的基因功能研究和定向遗传改良。为了能够快速高效地对甘蓝型油菜进行种质资源创新和遗传改良，将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于甘蓝型油菜恰逢其时。本文综述了目前CRISPR/Cas9系统应用于油菜基因功能研究和遗传改良的研究进展，涉及油菜产量、含油量和脂肪酸组成、生物和非生物胁迫耐受性等重要农艺性状，并探讨了油菜基因编辑存在的局限性以及未来发展的方向。

结合实验教学中实际经验和课程需求,利用学科优势,依托前沿科研成果,设计并建设了拟南芥CRISPR/Cas9基因编辑虚拟仿真实验系统,将虚拟仿真技术应用于遗传学实验教学。通过该实验系统,学生不仅可以自主学习并掌握基因编辑的相关理论知识和全过程实验操作,有效激发学习兴趣,还可以通过反复练习并配合实体实验教学,切实提高实践能力。该实验开拓了遗传学虚拟仿真实验新资源和实验教学新途径。

CRISPR/Cas9系统作为新一代基因组编辑技术,一经问世就受到广泛关注。CRISPR/Cas9系统具有对特定基因位点进行精确修饰(包括敲除、插入、替换等)的强大功能,同时具有操作简单、效率高、适应性广等技术优势,目前已在微生物、植物、动物以及人类基因治疗等整个生命科学领域得到应用。本文简要介绍了CRISPR/Cas9技术的发展历程、作用机理、技术优势、功能及应用领域,总结该技术在植物领域的基因组定向编辑中的研究进展。并提出了这项技术在草类植物基因功能分析、基因代谢调控途径与遗传改良等方面的应用前景,为

将CRISPR/Cas9系统与毛根转化相结合,在豆科植物百脉根和大豆中对结瘤因子受体激酶基因NFR1进行多靶点敲除,旨在快速、便捷获得目的基因突变体。结果表明:在百脉根和大豆中均获得了目的基因敲除的突变体;其中,百脉根LjNFR1基因中靶位点1处的敲除效率为58.3%,在靶位点2处的敲除效率为0;大豆GmNFR1靶位点1处的敲除效率为33.3%,靶位点2处的敲除效率为41.7%。进一步测序分析发现,CRISPR/Cas9系统可同时敲除大豆基因组上编码NFR1的2个同源基因(GmNFR1和GmNFR1b),

利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sgRNA位点，通过合成sgRNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体，再转染px330–Inhba–sgRNA载体到大鼠L6细胞，通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sgRNA编辑Inhba基因的效率。结果表明：转染pX330–Inbha–sgRNA载体后，Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带；T载体克隆测序显示，随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失，估测编辑效率为25%。可见，本研究设计的sgRNA能够有效的利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。

利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sgRNA位点，通过合成sgRNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体，再转染px330–Inhba–sgRNA载体到大鼠L6细胞，通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sgRNA编辑Inhba基因的效率。结果表明：转染pX330–Inbha–sgRNA载体后，Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带；T载体克隆测序显示，随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失，估测编辑效率为25%。可见，本研究设计的sgRNA能够有效的利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。

利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sg RNA位点,通过合成sg RNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体,再转染px330–Inhba–sg RNA载体到大鼠L6细胞,通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sg RNA编辑Inhba基因的效率。结果表明:转染p X330–Inbha–sg RNA载体后,Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带;T载体克隆测序显示,随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失,估测编辑效率为25%。可见,本研究设计的sg RNA能够有效利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。

利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sg RNA位点,通过合成sg RNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体,再转染px330–Inhba–sg RNA载体到大鼠L6细胞,通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sg RNA编辑Inhba基因的效率。结果表明:转染p X330–Inbha–sg RNA载体后,Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带;T载体克隆测序显示,随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失,估测编辑效率为25%。可见,本研究设计的sg RNA能够有效利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。

苹果酸脱氢酶（mdh）基因与肌肉的生长密切相关，可以通过影响骨骼肌的能量代谢来调节肌纤维的生长及类型转化，为探索mdh基因在团头鲂中的功能及作用，实验利用CRISPR/Cas9技术对团头鲂mdh基因进行敲除，并对敲除突变体的表型及基因表达变化进行了研究。结果显示，CRISPR/Cas9可成功应用于团头鲂mdh基因的敲除，与对照组相比，敲除突变体明显小于正常对照组个体，生长性状数据测量显示其体质量、体长都发生了显著的变化。qPCR结果显示，敲除突变体中mdh基因的表达水平显著低于对照组，并且，在敲除突变体中随着mdh基因表达水平的下降，生肌决定因子及肌纤维类型因子MyoG、MyHCⅡa也发生了显著的降低，而MyHCⅡb的表达并没有发生明显的变化。研究表明，CRISPR/Cas9可用于团头鲂基因的高效、快速编辑，也证明mdh基因敲除后可能会抑制团头鲂的生长，在团头鲂的生长过程中起着促进作用。这一研究结果为团头鲂的生长性状研究提供了一定的理论基础，有利于mdh基因在团头鲂分子育种中的合理应用。

ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９系统是近年发展起来的、由导向ＲＮａ介导的基因组定向编辑技术。总结了ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９基因组定向编辑技术的发展历程，并综述了其在作物遗传育种研究中的多方面应用。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ系统是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种后天免疫系统，以消灭外来质体或者噬菌体。根据ＣａＳ蛋白组分及氨基酸序列不同，已发现的ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ系统可以分为３种不同类型，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅱ型是以ＣａＳ９蛋白及导向ＲＮａ为核心组份，组成较为简单，是目前经过改造用于开发基因组定向编辑技术的主要类型。自ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９技术体系首先在人类与动物细胞系中建立后，经过改造的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ．．．

CRISPR/Cas9是一项热门的基因编辑技术,广泛应用于生命科学研究领域。文章尝试将该技术设计成适合本科教学的实验内容,即"CRISPR/Cas9敲除细胞线粒体MFN1基因的荧光观察实验",并可根据教学需要作为开放实验或基础实验开设。该实验将CRISPR/Cas9基因编辑技术与荧光标记技术相结合,直观、便捷地呈现基因编辑效果,有助于学生掌握科技前沿技术,提高科研工作兴趣,培养创新思维和科研综合素质。

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T_0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T_1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T_2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295μg·g~(-1),极显著(P<0.01)高于非转基因对照(0.046μg·g~(-1))。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。