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[期刊] 实验技术与管理
[作者]
赵慧 高永峰 周武艺 倪春林
综合制药工程专业实践教学要求和学科前沿方向,设计了"基于酵母杂交的CRISPR/Cas9基因编辑"实验。该实验先采用基因重组技术,分别构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,以及重组酵母yPH1和y PH6-8,再利用酵母杂交平台研究CRISPR/Cas9基因编辑载体的靶向性和脱靶机率。该实验内容包括微生物培养、微生物生长曲线绘制、基因重组技术、基因表达和CRISPR/Cas9基因编辑技术,以及学习Origin作图软件和荧光成像技术。该实验具有综合性、设计性和研究性特点,同时具有材料成本低、过程简化和结果明显的优势,不仅方便学生学习基因编辑原理,掌握基因编辑核心技术,了解脱靶效应的普通性,而且有利于培养学生的创造性思维,提高分析、解决问题的能力。
[期刊] 实验技术与管理
[作者]
王宏刚 魏远 李艳君 朱玉山
CRISPR-Cas9是一种现代生命科学研究中普遍使用的新型基因编辑技术。为了升级课程内容体系，使实验教学贴近科研实际，提升实验课程教学质量，南开大学遗传学实验课程组设计了T7核酸内切酶1（T7E1）检测CRISPR-Cas9基因编辑效果实验。以CRISPR-Cas9基因编辑技术对mfn1编辑过的HeLa细胞为实验材料，提取基因组DNA，PCR扩增mfn1基因片段，切胶回收后，变性，退火，使用T7E1对编辑效果进行检测。经1%琼脂糖凝胶电泳，可观察到T7E1将略大于500 bp的mfn1基因片段切成两条大小约为250 bp的DNA片段，表明CRISPR-Cas9成功地对mfn1进行了编辑。
[期刊] 实验技术与管理
[作者]
顾宁 曲有鹏 朱瑞娇 王长林 宋金柱 韩放
文章以CRISPR/Cas9基因编辑技术为基础，设计了面向非生物专业学生的“利用基因编辑技术建立靶基因敲除细胞系”实验课程。实验包括验证性和探索性内容，整合了生物信息学、分子生物学、细胞生物学、基因工程等多学科知识点，有利于加强学生对相关生命科学知识的理解，有利于提高学生综合实验设计能力和培养创新精神。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
许磊 何菡子 范楚川
油菜是世界第二大油料作物，同时也是我国最主要的食用植物油来源。长期以来，油菜育种工作者尝试通过传统育种策略培育良种。然而，甘蓝型油菜是种间杂交后双二倍进化而来的异源四倍体物种，其基因组中存在较多基因冗余现象。因此，通过人工杂交选择、随机诱变等传统遗传方法改良性状效率非常低。近年来，CRISPR/Cas9技术以其高效、简便的独特优势，已广泛应用于多倍体油菜的基因功能研究和定向遗传改良。为了能够快速高效地对甘蓝型油菜进行种质资源创新和遗传改良，将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于甘蓝型油菜恰逢其时。本文综述了目前CRISPR/Cas9系统应用于油菜基因功能研究和遗传改良的研究进展，涉及油菜产量、含油量和脂肪酸组成、生物和非生物胁迫耐受性等重要农艺性状，并探讨了油菜基因编辑存在的局限性以及未来发展的方向。
[期刊] 实验技术与管理
[作者]
霍颖异 王君晖 史影 王国强 吴敏
结合实验教学中实际经验和课程需求,利用学科优势,依托前沿科研成果,设计并建设了拟南芥CRISPR/Cas9基因编辑虚拟仿真实验系统,将虚拟仿真技术应用于遗传学实验教学。通过该实验系统,学生不仅可以自主学习并掌握基因编辑的相关理论知识和全过程实验操作,有效激发学习兴趣,还可以通过反复练习并配合实体实验教学,切实提高实践能力。该实验开拓了遗传学虚拟仿真实验新资源和实验教学新途径。
[期刊] 草业科学
[作者]
王丹 周美亮 李金博 孙占敏 吴燕民
CRISPR/Cas9系统作为新一代基因组编辑技术,一经问世就受到广泛关注。CRISPR/Cas9系统具有对特定基因位点进行精确修饰(包括敲除、插入、替换等)的强大功能,同时具有操作简单、效率高、适应性广等技术优势,目前已在微生物、植物、动物以及人类基因治疗等整个生命科学领域得到应用。本文简要介绍了CRISPR/Cas9技术的发展历程、作用机理、技术优势、功能及应用领域,总结该技术在植物领域的基因组定向编辑中的研究进展。并提出了这项技术在草类植物基因功能分析、基因代谢调控途径与遗传改良等方面的应用前景,为
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
谭茜 王龙祥 张先鹏 余海翔 张忠明
将CRISPR/Cas9系统与毛根转化相结合,在豆科植物百脉根和大豆中对结瘤因子受体激酶基因NFR1进行多靶点敲除,旨在快速、便捷获得目的基因突变体。结果表明:在百脉根和大豆中均获得了目的基因敲除的突变体;其中,百脉根LjNFR1基因中靶位点1处的敲除效率为58.3%,在靶位点2处的敲除效率为0;大豆GmNFR1靶位点1处的敲除效率为33.3%,靶位点2处的敲除效率为41.7%。进一步测序分析发现,CRISPR/Cas9系统可同时敲除大豆基因组上编码NFR1的2个同源基因(GmNFR1和GmNFR1b),
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
赵为民 涂枫 王泽平 程金花 付言峰 李碧侠 任守文
利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sgRNA位点，通过合成sgRNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体，再转染px330–Inhba–sgRNA载体到大鼠L6细胞，通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sgRNA编辑Inhba基因的效率。结果表明：转染pX330–Inbha–sgRNA载体后，Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带；T载体克隆测序显示，随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失，估测编辑效率为25%。可见，本研究设计的sgRNA能够有效的利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
赵为民 涂枫 王泽平 程金花 付言峰 李碧侠 任守文
利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sgRNA位点，通过合成sgRNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体，再转染px330–Inhba–sgRNA载体到大鼠L6细胞，通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sgRNA编辑Inhba基因的效率。结果表明：转染pX330–Inbha–sgRNA载体后，Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带；T载体克隆测序显示，随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失，估测编辑效率为25%。可见，本研究设计的sgRNA能够有效的利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
赵为民 涂枫 王泽平 程金花 付言峰 李碧侠 任守文
利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sg RNA位点,通过合成sg RNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体,再转染px330–Inhba–sg RNA载体到大鼠L6细胞,通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sg RNA编辑Inhba基因的效率。结果表明:转染p X330–Inbha–sg RNA载体后,Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带;T载体克隆测序显示,随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失,估测编辑效率为25%。可见,本研究设计的sg RNA能够有效利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
赵为民 涂枫 王泽平 程金花 付言峰 李碧侠 任守文
利用chopchop网站对大鼠Inhba基因的第二外显子设计sg RNA位点,通过合成sg RNA寡核苷酸、酶切连接构建到px330载体,再转染px330–Inhba–sg RNA载体到大鼠L6细胞,通过T7E1酶切、T载体克隆测序来验证sg RNA编辑Inhba基因的效率。结果表明:转染p X330–Inbha–sg RNA载体后,Inhba基因的编辑区域的PCR产物能被T7E1酶切割预期条带;T载体克隆测序显示,随机选取的20个单克隆中有5个克隆在预期切割位点附近出现不同长度的碱基缺失,估测编辑效率为25%。可见,本研究设计的sg RNA能够有效利用CRISPR/Cas9系统对Inhba基因进行编辑。
[期刊] 水产学报
[作者]
郭丹丹 郑国栋 陈杰 邹曙明
苹果酸脱氢酶（mdh）基因与肌肉的生长密切相关，可以通过影响骨骼肌的能量代谢来调节肌纤维的生长及类型转化，为探索mdh基因在团头鲂中的功能及作用，实验利用CRISPR/Cas9技术对团头鲂mdh基因进行敲除，并对敲除突变体的表型及基因表达变化进行了研究。结果显示，CRISPR/Cas9可成功应用于团头鲂mdh基因的敲除，与对照组相比，敲除突变体明显小于正常对照组个体，生长性状数据测量显示其体质量、体长都发生了显著的变化。qPCR结果显示，敲除突变体中mdh基因的表达水平显著低于对照组，并且，在敲除突变体中随着mdh基因表达水平的下降，生肌决定因子及肌纤维类型因子MyoG、MyHCⅡa也发生了显著的降低，而MyHCⅡb的表达并没有发生明显的变化。研究表明，CRISPR/Cas9可用于团头鲂基因的高效、快速编辑，也证明mdh基因敲除后可能会抑制团头鲂的生长，在团头鲂的生长过程中起着促进作用。这一研究结果为团头鲂的生长性状研究提供了一定的理论基础，有利于mdh基因在团头鲂分子育种中的合理应用。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
景润春 卢洪
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９系统是近年发展起来的、由导向ＲＮａ介导的基因组定向编辑技术。总结了ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９基因组定向编辑技术的发展历程，并综述了其在作物遗传育种研究中的多方面应用。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ系统是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种后天免疫系统，以消灭外来质体或者噬菌体。根据ＣａＳ蛋白组分及氨基酸序列不同，已发现的ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ系统可以分为３种不同类型，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅱ型是以ＣａＳ９蛋白及导向ＲＮａ为核心组份，组成较为简单，是目前经过改造用于开发基因组定向编辑技术的主要类型。自ＣＲＩＳＰＲ／ＣａＳ９技术体系首先在人类与动物细胞系中建立后，经过改造的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ．．．
[期刊] 实验技术与管理
[作者]
魏远 王宏刚 孟琦 王家乐 李艳君 朱玉山 赵立青
CRISPR/Cas9是一项热门的基因编辑技术,广泛应用于生命科学研究领域。文章尝试将该技术设计成适合本科教学的实验内容,即"CRISPR/Cas9敲除细胞线粒体MFN1基因的荧光观察实验",并可根据教学需要作为开放实验或基础实验开设。该实验将CRISPR/Cas9基因编辑技术与荧光标记技术相结合,直观、便捷地呈现基因编辑效果,有助于学生掌握科技前沿技术,提高科研工作兴趣,培养创新思维和科研综合素质。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
黄娟 高利军 李经成 周维永 邓国富 潘英华 卿冬进 陈韦韦 伍豪 戴高兴
【目的】通过CRISPR/Cas9技术同时编辑多个粒型基因，获得粒长增加、粒宽降低的理想粒型，快速提高三系杂交稻恢复系的外观品质，为三系杂交稻提供优良亲本材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技术在恢复系桂恢582（GH582）中同时敲除粒型基因GS3、GW8和TGW3，在T_(2)代选择突变位点纯合无标记基因且符合预期目标的单株鉴定为新恢复系，并对新恢复系进行主要农艺性状及透明度、垩白度、垩白粒率等米质相关性状分析。【结果】对恢复系GH582多个不同粒型突变单株的3个突变基因位点进行测序分析，获得4种突变类型：GW8tgw3GS3，GW8TGW3gs3，gw8TGW3gs3和gw8tgw3gs3。结合粒型分析显示gs3及tgw3基因的单独突变都显著增加了籽粒长（P<0.05，下同）；籽粒宽的显著下降主要来自gw8突变；三者同时突变（gw8tgw3gs3）使得籽粒长增加的叠加效应明显。选择三基因位点突变体（gw8tgw3gs3）鉴定为新恢复系GH582E。农艺性状分析显示，GH582E相较GH582，籽粒长由8.62 mm增加至10.21 mm，增加了18.4%；籽粒宽度由2.82 mm下降至2.45 mm，下降了13.1%，其他农艺性状无显著变化（P>0.05）。米质分析显示，由于GH582E米粒长增加，米粒宽降低，使得透明度升高，垩白粒率和垩白度极显著下降（P<0.01），外观品质得到提升。【结论】通过CRISPR/Cas9技术改良粒型可快速提升水稻恢复系的外观品质，促进现有资源的有效利用，提高杂交稻亲本的育种效率。
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