针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因保守序列设计2对引物,建立了SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,实现了同一反应管内同时检测AIV的H5和N1亚型基因。熔解曲线分析显示,H5和N1扩增片段的熔解温度分别为(79.5±0.3)℃和(83.3±0.3)℃,无引物二聚体形成,扩增产物片段大小分别为150 bp和474bp,与预期大小相符,测序结果证实为H5和N1亚型基因的靶序列。该方法能从H5N1样本中检出阳性扩增信号,熔解曲线可见H5和N1双特异峰;而H5N2样本有阳性扩增,熔解曲线仅见H5单特异峰。AIV的其他HA亚型和其他病毒的RNA、DNA无扩...

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Acce...

为了建立简便、快速的AIV检测方法,根据禽流感病毒H5、H7、H9亚型HA基因和N1亚型NA基因的保守序列,设计了4对RT-PCR引物,对H5、H7、H9、N1 4个亚型进行了多重RT-PCR扩增,通过多重RT-PCR敏感性和特异性试验,建立了多重RT-PCR检测方法;应用所建立的多重RT-PCR方法和病毒分离的经典方法对395份(4省20多个地区)口岸检样进行了平行检测,并对其检测结果进行了比较。结果表明,H5、H7、H9、N1 4个亚型的扩增产物大小分别为380,641,493和328 bp,对NDVI、BV、ARVI、BDV、MDV、FPV扩增均为阴性,平行检测结果完全吻合,说明所建立的...

【目的】为了验证H5N1亚型禽流感病毒对鸭是否具有致病作用。【方法】对2003年某地方养鹅场发病鹅群分离的一株H5N1亚型流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/2003的生物学特性和致病性进行研究。【结果】动物实验表明该病毒对不仅对鸡具有高致病性(IVPI=3),而且对鸭也具有高致病性。雏鸭人工感染该病毒后临床表现典型的神经症状,剖检可见脑膜点状出血,肝脾肿大并见有坏死灶,肺脏严重充血、出血,消化道粘膜弥散性出血。病理组织学检查发现全身各脏器以出血、充血、细胞变性坏死和炎性细胞浸润为主要特征,并表现为不同程度的损伤。感染鸭死亡集中在感染后的4～6d,致死率75%。雏鸭在病毒感染后2～4d的气...

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计引物,PCR扩增NA基因,再将其克隆到原核表达载体pET-32a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为61 kDa,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。

【目的】验证斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性,测定斑鸠呼吸道上皮细胞表面流感病毒受体的类型和分布。【方法】以5×104EID50/只的剂量经滴鼻、点眼途径感染A/Chicken/Beijing/2/2009(H9N2)亚型禽流感病毒,共感染8只斑鸠和8只SPF鸡,对试验斑鸠和SPF鸡进行临床症状、大体病变、组织学病变的观察及病毒抗原的定位、病毒分离和感染抗体的测定。【结果】攻毒后5d,斑鸠和SPF鸡未见异常临床表现和大体病变,病理组织学检查发现斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞均有不同程度的脱落;在斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞的胞浆内检测到了大量阳性流感病毒蛋白颗粒;斑鸠...

【背景】H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）广泛流行于我国南方地区，是我国家禽中最常见AIV之一。H6N1亚型AIV频繁地与其他野鸟源毒株重配，并且可以作为供体为高致病性AIV提供内部基因片段，产生新型重组病毒，进而威胁人类健康。【目的】通过对我国H6N1亚型AIV的演化动态及其相关生物学特性分析研究，为我国禽流感的综合防控提供数据支持。【方法】采集2019—2022年我国25个省（直辖市、自治区）的活禽交易市场及养殖场家禽喉和泄殖腔拭子，通过接种鸡胚分离到7株H6N1亚型AIVs并对其进行全基因组测序，分析其遗传演化特征、受体结合特性及其对SPF鸡和BALB/c小鼠的感染性。【结果】遗传演化分析表明，7株病毒的基因与分离于北美及东南亚地区的野鸟源病毒基因同源性较高，基因来源复杂，具有明显的遗传多样性。贝叶斯演化分析表明，H6亚型AIV HA基因曾发生过多次的跨洲际传播，欧亚谱系病毒在北美地区也有着较长时间流行。1株病毒HA基因与北美地区毒株基因高度同源，根据贝叶斯演化分析结果，推测该病毒在野鸟体内经历了复杂的基因重配后形成，后经野鸟传入我国。特殊氨基酸位点分析结果显示，病毒HA蛋白裂解位点序列均为PQIETR↓GLF，符合低致病性AIV特征；此外，另有1株病毒的NP蛋白发生Y52H突变，据报道，该突变对AIV获得抵抗人干扰素刺激基因BTN3A3的能力起到关键作用。受体结合特性分析表明，部分毒株具有双受体结合特性，但结合人源受体能力弱于结合禽源受体能力。病毒对SPF鸡的感染性试验表明，鸡感染A/chicken/Jiangxi/S40445/2019(H6N1)后能通过呼吸道及消化道排毒，并且病毒可在鸡群内通过接触传播。鸡感染A/duck/Jiangxi/S10941/2019(H6N1)后仅有少数鸡通过呼吸道排毒，病毒无法在鸡群间通过接触传播。BALB/c小鼠的感染性试验表明，H6N1亚型AIV无需提前适应便可在小鼠呼吸道内有效复制，但对小鼠仍呈低致病力。【结论】2019—2022年分离于我国的H6N1亚型AIV基因大部分来源于野鸟源病毒，候鸟可经东亚-澳大利亚迁徙路线将病毒传入我国；部分病毒能够结合人源唾液酸受体并在小鼠呼吸道内有效复制，表明该亚型病毒对公共卫生安全构成潜在威胁。

A/goose/Guangdong/1/96(GSGD/1/96)是中国分离的第1株H5N1亚型禽流感病毒,它不仅是97香港感染并致人死亡的H5N1亚型流感病毒HA基因供体株,而且是中国目前已报到的H5亚型流感病毒分离株的共同祖先。本研究建立了该病毒的8质粒反向基因操作系统,并通过细胞转染成功拯救了该病毒(R-GSGD/1/96)。R-GSGD/1/96在对SPF鸡和Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野毒(W-GSGD/1/96)一致的生物学特性,即对鸡都是高致病性毒株,R-GSGD/1/96与W-GSGD/1/96的静脉致病指数分别为2.01和2.10;救获病毒与野生病毒一样,尽管10...

参考GenBank上H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计引物,PCR扩增NP基因,对其进行序列分析并构建分子进化树。将克隆的NP基因插入原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中进行诱导表达,对诱导表达的NP重组蛋白进行纯化、Western-Blot鉴定及免疫原性分析。结果表明,克隆的NP基因与GenBank上发表的另外2个河南AIV毒株亲缘关系较近,诱导表达的NP重组蛋白主要以可溶性形式存在,分子量约为70 kDa,并且能够与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。

为利用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)生物传感器建立一种快速检测H5N1流感病毒的新方法。该研究利用SPR生物传感器以及H5N1单克隆抗体,对H5N1流感病毒样品进行检测分析。结果表明:该方法特性如下:1)可实现针对H5N1流感病毒的直接、快速和实时检测,整个过程无需任何标记;2)检测限为104.44 TCID50/mL,低于ELISA方法的103.24 TCID50/mL;3)在抗体消耗量方面,SPR技术要优于ELISA技术近100倍。

用SPF鸡胚从2005-2006年采集自天津地区猪群样品中分离出3株猪流感病毒,测定了分离病毒的部分理化特性和生物学特性。3个猪流感病毒分离株均能凝集1%鸡红血球,将其制成琼脂扩散抗原与猪流感标准阳性血清反应均出现清晰白色沉淀线;经中国动物卫生与流行病学中心系统鉴定,3个毒株均为H1N1亚型,分别命名为A/Swine/Tianjin/TJ2/2005(H1N1)、A/Swine/Tianjin/TJ3/2005(H1N1)、A/Swine/Tianjin/TJ4/2006(H1N1)株。这3株病毒都为热不稳定型,60℃作用10 min即可使病毒失去感染能力,病毒对酸性环境(pH3.0)和乙醚均...

［目的］本文旨在了解Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒神经氨酸酶（ＮＡ）基因的遗传特点和变异情况。［方法］选择２００８—２０１３年从江苏、安徽和浙江省家禽中分离的１１株Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒，用ＲＴ－ＰＣＲ方法对ＮＡ基因片段进行扩增、克隆和序列测定，并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性及遗传进化分析。［结果］１１株毒株的ＮＡ基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为８６．２％～９９．５％和８６．９％～９９．１％，均属于欧亚分支。其中９株鸡源毒株属于Ｙ２８０－ｌｉｋｅ亚系，在ＮＡ蛋白颈部６３～６５位点缺失了３个氨基酸；２株鸭源毒株属于Ｇ１－ｌｉｋｅ亚系，在颈部３９～４０位点缺失了２个氨基酸。１１株分离株除．．．

为调查我国多个省份鸡群中发生一种以眼睑肿胀出血、呼吸道症状、产蛋鸡产蛋率急性下降为特征的传染性疾病的致病病原，本研究对发病鸡群进行流行病学调查，病原分离鉴定，病毒全基因序列分析，并对分离病毒进行了动物回归试验。结果表明：1）该病自2021年12月首先发现于广东省某三黄鸡群，随后陆续在福建、安徽、江苏、河南等多个省份鸡群中发生，鸡群发病率高，后期易继发感染细菌，死亡率1%～10%;2）实验室初步诊断为H3N8亚型禽流感；3）全基因组序列分析表明，该病毒为新型禽流感病毒，系欧亚禽分支H3基因、北美禽分支N8基因与G57基因型H9N2病毒内部基因组成的三源重排病毒；4）新型H3N8病毒对SPF鸡高度易感，感染鸡表现为眼睑肿胀出血，轻微呼吸道症状；病理变化为哈德氏腺黏膜坏死，鼻甲、气管纤毛上皮细胞坏死，黏膜下层炎性细胞浸润，肺脏支气管肺炎；病毒可通过口咽和泄殖腔排毒，排毒时间为5～7d；病毒在鼻甲、气管和肺脏中可高效复制，并且可以在哈德氏腺等肺外脏器复制。综上，新型三源重排H3N8禽流感病毒对鸡高度适应，对呼吸系统致病性较强，应尽快开展系统的流行病学监测，及早对病毒的源头及传播途径进行防控，力争将这种新型病毒消灭在流行早期阶段。

旨在分析环境低温对H9N2亚型禽流感病毒感染小鼠致病性的影响。选用120只6～8周龄,雄性SPF BALB/c小鼠,随机分为4组:无感染常温组(PBS处理,(20±2)℃)、无感染低温组(PBS处理,(10±2)℃)、H9N2病毒感染常温组(H9N2处理,(20±2)℃)、H9N2病毒感染低温组(H9N2处理,(10±2)℃)。在感染后观察感染小鼠发病14d内的临床症状、存活率,肺脏病变程度、肺部细胞因子含量的动态变化以及肺脏病毒载量。结果表明:1)与H9N2病毒感染常温组小鼠相比,环境低温处理的H9N2病毒感染小鼠临床症状明显加重,其中体重明显降低,但差异不显著(P>0.05),存活率由95%降为67%,肺水肿程度和肺组织病变程度更加严重;2)H9N2病毒感染低温组与H9N2病毒感染常温组相比,肺脏TNF-a和IL-1β含量无显著差异,但均显著高于2个无感染组(P<0.01);3)H9N2病毒感染低温组与H9N2病毒感染常温组相比,肺组织病毒载量显著增加(P<0.01)。综上,环境低温明显增加了H9N2亚型流感病毒对小鼠的致病性,为进一步揭示环境低温与流感病毒感染之间的关系,以及采取有效的预防措施提供数据基础。

为了解湖北鸡源禽流感病毒的遗传进化和氨基酸变异情况,将分离到的2株禽流感病毒进行全基因组测序及遗传进化分析。利用RT-PCR扩增流感病毒基因组片段,PCR扩增流感病毒片段、克隆至pMD18-T载体,并对序列特征进行生物信息学分析。结果表明:分离到的2株病毒高度同源,其HA和NA基因属于Y280谱系,PB1、PA、NP和NS基因属于SHF98-like谱系,PB2和M基因属于G1-like谱系;HA裂解位点均为-RSSR↓GLF-,具有低致病性流感病毒的分子特征;在HA蛋白上比当前流行株Y280多了一个潜在糖基化位点313(NCS);在234位点(对应H3编号中的226)产生了从Q到L的突变;在M2蛋白的31位点均产生了从S到N的突变。该2株H9N2亚型流感病毒为Y280谱系的病毒,这提示湖北地区可能也流行Y280-like分支禽流感病毒,虽然属于低致病性禽流感病毒(Low pathogenic AIV,LPAIV),但具有感染哺乳动物的潜在风险。