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[期刊] 中国农业科学  [作者] 胡骁飞  李青梅  姚静静  胡思宇  孙亚宁  邢云瑞  邓瑞广  张改平  
【目的】获取高灵敏度的玉米赤霉醇(zearalanol,ZAL)单克隆抗体,为提高玉米赤霉醇免疫学检测方法灵敏度研究奠定基础。【方法】利用ZAL的结构类似物玉米赤霉酮(zearalanone, ZAN)制备人工完全抗原。肟化改造ZAN得到ZAN-O;碳二亚胺(EDC)法把ZAN-O分别连接到牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上制备出ZAN-O-BSA和ZAN-O-OVA。ZAN-O-BSA免疫小鼠,免疫剂量为50μg蛋白/只鼠。选取血清效价高、灵敏度好的小鼠进行细胞融合。阳性杂交瘤筛选过程中,利用ZAL替代ZAN作为阻断剂,筛选能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞。体内诱生腹水法来批量制备ZAL单抗,并对单抗的免疫学性能进行了鉴定。【结果】通过细胞融合,阳性杂交瘤筛选得到了1株能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为12B10A7,其分泌的ZAL单抗灵敏度(半数抑制浓度, IC50)为577 pg·mL~(-1),亲和力常数Ka=6.21×10~7 L·mol~(-1),与结构类似物β-玉米赤霉醇(β-zearalanol,β-ZAL)、α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol,α-ZEL)、β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol,β-ZEL)、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)分别有43.06%、15.51%、15.22%、77.65%及9.79%的交叉反应率,而与其他霉菌毒素及载体蛋白交叉反应率均<0.06%。【结论】基于抗体交叉反应特性,利用ZAN制备人工抗原,得到了ZAL的单克隆抗体,所制备的单克隆抗体亲和力高,灵敏度好,特异性强。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)  [作者] 张鸯  陶明亮  路保通  靳亚平  
【目的】制备抗Zhangfei蛋白的单克隆抗体,并鉴定其特性。【方法】用Zhangfei融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0融合,筛选出阳性克隆,应用有限稀释法筛选抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤株;采用腹水诱生法制备单抗腹水,用饱和硫酸铵法纯化腹水抗体;采用间接ELISA、单克隆抗体亚型检测试剂盒、免疫印记技术、曲线拟合方案等分别鉴定单抗效价、亚型、特异性和亲和力等特性。【结果】免疫小鼠的血清抗体效价达1∶5 000以上,细胞融合克隆率为98.96%,阳性克隆率为30.18%,筛选出2株抗Zhangfei蛋白的单克隆杂交瘤细胞,其培养上清效价均达到1∶800,腹水单...
[期刊] 华北农学报  [作者] 胡骁飞  魏凤仙  李青梅  职爱民  王方雨  孙亚宁  柴书军  付晓鹤  
通过细胞融合建立分泌抗植酸酶单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,筛选出2株杂交瘤细胞,其中,5C3细胞株产生单抗亚型为IgG1型,效价为1∶(1.02×106),IC50=100.07 ng/mL,亲和常数为6.70×109L/mol,与市售常规植酸酶、包被植酸酶及浓缩植酸酶的IC50分别达到130.43,126.16,125.33 ng/mL,交叉反应率分别为76.72%,79.32%和79.84%。与高温失活(100℃水煮5 min)的麸皮植酸酶、普通植酸酶、包被植酸酶及浓缩植酸酶IC50分别为4 205.45,4 01...
[期刊] 中国农业科学  [作者] 蔡勤仁  曾振灵  杨桂香  陈杖榴  方炳虎  
碳二亚胺法合成了2种恩诺沙星(enrofloxacin,ENFX)人工抗原ENFX-BSA和ENFX-OVA,用紫外扫描和分析载体蛋白的氨基酸组成等方法对人工抗原进行鉴定,ENFX与BSA的结合比约为48∶1。用ENFX-BSA免疫BALB/C小鼠,采用显微克隆技术最终筛选出2株特异性分泌细胞2C5和5D5并获取腹水,纯化后腹水效价分别为1∶3200和1∶6400。2C5和5D5均属IgG2a型抗体。单抗5D5间接竞争ELISA(Ci-ELISA)的工作浓度为1∶1000,ENFX的抑制曲线在0.13~10 000 ng·ml-1之间线性关系良好(r =-0.9782),检测限(LOD)为0....
[期刊] 水产学报  [作者] 宋晓玲  黄倢  史成银  
小鼠骨髓瘤细胞系SP2 / 0与经溶藻弧菌 (1.15 87)免疫的BALB/C雌鼠脾细胞在PEG条件下融合 ,有4 5 .8%的培养孔有杂交瘤细胞生长 ,其培养上清液抗体阳性率为 77.4 %。经反复有限稀释法克隆杂交瘤细胞 ,获得 7株抗溶藻弧菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,分别为 :AC1-C9,AC1-C11,BB4-D4,AD1-A3 ,AD1-F3 ,AD2 -E7,AD2 -F7。取AD1-F3 扩大培养 ,注射小鼠 ,制备了抗溶藻弧菌的单克隆抗体腹水 ,滴度为 1∶10 0 0。该腹水与其他 3株溶藻弧菌菌株有强交叉反应 ,与其他 13株标准菌株无交叉反应。利用制备的单抗腹水 ,...
[期刊] 华北农学报  [作者] 胡世享   叶玲玲   肖妍   卓娜   王滕芬   汪琳   蒲静   陈培富   艾军  
为建立一种用于快速检测赤羽病病毒抗体的竞争ELISA法。用AKV病毒免疫Balb/C小鼠,将其脾细胞与SP2/0细胞进行免疫融合,以获得抗AKV的单克隆抗体;利用Bac-to-Bac杆状病毒表达的SBV N蛋白作为诊断特异性抗原,山羊抗鼠HRP-IgG为二抗,建立并优化AKV抗体检测的竞争ELISA方法。得到一株持续稳定繁殖的能够分泌单抗AKV核蛋白抗体的杂交瘤细胞株,单抗亚型鉴定为:重链IgG1,轻链kappa,仅能与AKV病毒呈阳性反应,与BTV、FAMD、EHDV病毒等病毒抗原不发生特异性反应;建立的检测AKV抗体ELISA检测方法,诊断抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,1∶1 000抗体稀释比,1∶50血清稀释比,1∶2 000二抗稀释比,封闭条件为5%BSA,37℃封闭2 h,确定了血清抑制率大于等于44%时为阳性,小于44%为阴性;所建立的ELISA方法敏感性和特异性鉴定结果与ID Screen AKV Competition检测试剂盒一致。本试验成功制备出一株分泌针对AKV N蛋白的杂交瘤细胞系,建立的ELISA检测方法能够用于检测动物AKV抗体,为进一步开展AKV抗体诊断试剂工艺研究、产业化奠定了基础。
[期刊] 中国农业科学  [作者] 职爱民  李青梅  刘庆堂  刘宣兵  杨继飞  杨苏珍  柴书军  杨艳艳  邓瑞广  张改平  
【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)  [作者] 李晓  兰向莉  徐晓彬  杨延周  赵宝玉  靳亚平  王爱华  LU Ray  
【目的】制备抗Luman募集因子N端(Luman-recruiting factor N terminal,LRF-N)蛋白的单克隆抗体。【方法】PCR扩增LRF-N端的194bp序列,构建LRF-N重组质粒pGEX-LRF-N,转染BL21(DE3)菌,诱导表达并纯化GST-LRF-N融合蛋白,以其作为抗原免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,免疫4次,每次间隔10d,第4次加强免疫3d后采取小鼠脾脏,分离脾细胞,与SP2/0细胞融合,用ELISA和Western blot进行阳性细胞株的筛选和鉴定,对获得的杂交瘤细胞的细胞核型、分泌稳定性以及所分泌的单克隆抗体进行鉴定。【结果】pGEX-LR...
[期刊] 南京农业大学学报  [作者] 吴贤福  陈溥言  蔡宝祥  
马立克氏病病毒(MDV)的分子生物学研究已有20多年的历史,新技术的应用为病毒的分类、疾病的诊断和防治提供了有效的手段。MDV 通过琼脂扩散试验可被分为 A、B、C 三种主要抗原。目前已证明 B 抗原既可引起宿主的体液免疫,又可引起宿主的细胞免疫,是一种重要的中和性抗原。本试验利用提纯的 MDV B 抗原基因的大肠杆菌表达产物制备单克隆抗体,试图为 MDV 亚型的区别和真核生物系统中 B 抗原表达的鉴定提供帮助。
[期刊] 华北农学报  [作者] 刘儒彪  胡骁飞  张改平  王慧  王方雨  刘璐  刘玺  邓瑞广  宋照军  
为制备敏感性好、亲和力高、特异性强的抗沙拉沙星(Sarafloxacin,Sara)单克隆抗体,采用碳二亚胺法合成Sara人工抗原,通过免疫BalB/c小鼠,选择血清效价高且敏感性好的小鼠,采用杂交瘤细胞技术进行细胞融合,筛选分泌抗Sara单克隆抗体(Monoclonal antiBody,MaB)的杂交瘤细胞株;采用体内诱生腹水法制备Sara MaB,通过间接EliSa和间接竞争EliSa对Sara MaB的免疫学特性进行鉴定。结果表明:小鼠经免疫原免疫后,小鼠多抗血清效价均达到1∶128 000。选择敏感性较好的2号小鼠进行细胞融合,经多次亚克隆后,筛选出1G3、3H3两株杂交瘤细胞株,其...
[期刊] 水产学报  [作者] 查智辉  施慧  许文军  谢建军  孙忠  
用血卵涡鞭虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经常规融合、间接ELISA方法筛选,将所得阳性克隆再经3次亚克隆后,共获得3株针对血卵涡鞭虫的单克隆抗体(2B2、3G4、4G7),单克隆抗体亚类鉴定表明,三者为IgG类抗体。用筛选的杂交瘤细胞株制备小鼠腹水抗体,其细胞上清及腹水效价分别为5.12×10-4和8.00×10-4。进一步利用单克隆抗体建立间接荧光抗体方法对单抗特异性进行鉴定,阳性虫体被染上黄绿色荧光,而正常梭子蟹血淋巴则未被染色。用单克隆抗体和多克隆兔抗血清以羊抗鼠HRP-IgG为酶标抗体,建立了检测血卵涡鞭虫的双抗体夹心ELISA方法,该方法对血卵涡鞭虫阳性标本检测符合率为100%。...
[期刊] 水产学报  [作者] 朱晓真  王俊亚  贾钊  王梓璇  王邦杰  邹钧  
Ⅱ型干扰素,也称干扰素-γ(IFN-γ),是参与辅助性T淋巴细胞1(Th1)免疫应答的关键细胞因子之一。研究表明,鱼类与哺乳类Ⅱ型干扰素同源,不同的是真骨鱼类(Teleost)有两种Ⅱ型干扰素,即IFN-γ和干扰素-γ相关因子(IFN-γrel)。迄今,对鱼类IFN-γ基因的表达规律和功能已有大量报道,而对IFN-γrel的研究尚不深入,产生IFN-γ和IFN-γrel的细胞来源不清楚,它们是否有功能差异也存在争议。为此,本研究构建原核表达质粒,在大肠杆菌DE3中表达草鱼(Ci)IFN-γ和CiIFN-γrel重组蛋白。实验结果显示,重组CiIFN-γ蛋白为可溶性蛋白,而CiIFN-γrel蛋白则不可溶。通过亲和层析和分子筛层析获得了高纯度CiIFN-γ和CiIFN-γrel重组蛋白,免疫小鼠制备了单克隆抗体。通过Western Blotting筛选获得4株特异性高、亲和力强的抗体,结果表明CiIFN-γ单克隆抗体与CiIFN-γrel没有交叉反应,反之亦然,其中FITC标记的两株抗体可用于免疫荧光和流式细胞术分析。此外,Western Blotting分析显示草鱼IFN-γ和IFN-γrel单克隆抗体不识别斑马鱼的同源Ⅱ型干扰素蛋白。本研究制备了首个IFN-γrel的单克隆抗体,为深入研究草鱼Ⅱ型干扰素的产生和生物学功能奠定基础。
[期刊] 华北农学报  [作者] 宋艳华  胡波  范志宇  彭伟  魏后军  薛家宾  徐为中  王芳  
为了筛选兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)的特异性单抗,并进一步分析单抗识别表位的分布情况,将重组杆状病毒r Ac V-Bac-VP60接种Sf9昆虫细胞,收获细胞培养物,电镜观察显示重组VP60蛋白获得有效表达,并可组装成病毒样粒子(VLPs)。将RHDV VLPs作为免疫原与等量弗氏佐剂乳化,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经3次亚克隆后,获得11株能稳定分泌抗RHDV VLPs抗体的阳性杂交瘤细胞株。间接ELISA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,这11株单克隆抗体均能够特异地识别RHDV VLPs和天然RHDV。11株单抗均为Ig G1...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)  [作者] 赵丹丹  刁有祥  杨国平  陈浩  提金凤  张璐  
【目的】制备鸭瘟病毒(DPV)gB蛋白单克隆抗体,为建立DPV快速诊断方法及进一步鉴定DPV的抗原表位奠定基础。【方法】克隆DPVgB基因,构建其表达载体并进行原核表达,纯化DPV gB蛋白,以其作为抗原免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,进行间接ELISA及亚克隆筛选,并对单抗亚类及抗原性进行鉴定。【结果】PcR扩增出915BP的目的基因,成功连接于PET-28A载体,并转化大肠杆菌RoSETTA进行诱导表达,获得4株稳定分泌抗DPV gB蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为A8D7、E6c3、H11F8、H6F6,间接ELISA检测其腹水效价分别为1∶103、1...
[期刊] 水产学报  [作者] 刘问  钱冬  吴建翔  邵健忠  
罗氏沼虾肌肉白浊病(whitish muscle disease of Macrobrachium rosenbergii)是一种发生在罗氏沼虾苗种阶段的流行病,发病虾苗出现肌肉白浊、白斑或白尾症状,死亡率高达60%以上。作者所在实验室在确定其病原是罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii Nodavirus,MrNV)的基础上,用MrNV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,得到12株能特异分泌抗MrNV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞。注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶10...
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