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[期刊] 中国农业科学
[作者]
张留圈 张霄 刘媛 徐重新 张存政 谢雅晶 寇莉萍 刘贤金
【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为"捕获抗体",...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘媛 Huovinen Tuomas 刘贤金 梁颖 张存政 谢雅晶 贺江 王耘 张霄
【目的】从鼠源合成噬菌体抗体库中,快速分离获得微囊藻毒素LR单链抗体。【方法】采用磁珠筛选和负筛选方法,设计两轮微囊藻毒素LR单链抗体的筛选方案。用噬菌体产出投入比和多克隆噬菌体免疫分析,对每轮筛选后微囊藻毒素LR特异性噬菌体的富集效果进行鉴定。再将第2轮筛选获得的次级库提取单链抗体基因,转入可溶性表达载体;诱导表达后,采用时间分辨荧光免疫法,对单个噬菌体克隆鉴定并测序。【结果】两轮筛选的噬菌体产出投入比分别为4.8×10-8和2.88×10-6。第2轮筛选后的次级库,经多克隆噬菌体免疫分析得到的荧光信噪比,比原始抗体库提高了22.8倍。最终鉴定得到5株不同的阳性噬菌体克隆,其中最佳的克隆对微...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
徐重新 张存政 张霄 刘媛 黄鹰 刘贤金
利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立了Cry1B毒素蛋白的ELISA检测方法。方法以展示scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB2151,经PCR和基因测序检测克隆scFv基因片段的完整性,用SDS-PAGE方法检测scFv在E.coli HB2151宿主菌中的表达水平,用ELISA测定法检测scFv的抗原结合活性...
[期刊] 华北农学报
[作者]
安世恒 郭线茹 罗梅浩 蒋金炜 马继盛
利用RT-PCR技术扩增烟夜蛾(HelicoverpaassultaGuen啨e)幼虫中肠Bt毒素Cry1Ac受体蛋白APN(N-氨基肽酶,aminopeptidaseN,APN)基因片段,克隆和测序结果表明,测序得到的812bp的片段编码270个氨基酸残基,且该片段在阅读框内。通过同源性分析发现,其核苷酸序列与棉铃虫(H.armigera)、澳洲棉铃虫(H.punctiger a)、烟芽夜蛾(H.virescens)、舞毒蛾(Lymantriadispar)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、印度谷螟(Plodiainterpunctella)RC688品系和HD198品系、烟...
关键词：
烟夜蛾 Bt 受体蛋白 cDNA 克隆
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘贝贝 张霄 谢雅晶 焦凌霞 刘媛 张存政 赵岩岩 武爱华 刘贤金
【目的】分析定位Ｂｔ Ｃｒｙ１类毒素Ｃｒｙ１ＡＢ、Ｃｒｙ１ＡＣ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｆ的共性结构域，克隆并表达共性结构域蛋白，为筛选Ｂｔ毒素广谱抗体及建立广谱检测方法打下基础。【方法】利用生物信息学和分子模拟技术，通过ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ同源建模分别对５种Ｃｒｙ１类毒素进行三维建模，并结合ｒＡＭＡＣｈＡｎＤｒＡｎ ｐＬＯｔ、ＥｒｒＡｔ和ＶＥｒＩＦｙ３Ｄ方法评价模型构象的合理性。通过分析比对５种Ｃｒｙ１类毒素的三维结构，确定ＤＯＭＡＩｎⅠ区域作为５种Ｃｒｙ１毒素的共性结构域。以含Ｃｒｙ１ＡＣ基因的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种为模板设计引物，ｐＣｒ扩增获得共性结构域ＤＯＭＡＩｎⅠ基因，．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
陈琼 陆承平
以福尔马林灭活的嗜水气单胞菌 HEC 毒素免疫 Balb/C 小鼠,取其脾细胞与 SP2/O 细胞融合,用间接ELISA 筛选,获得9株分泌 HEC 毒素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,腹水 ELISA 效价为1∶640～1∶20 480。其中8株能特异性抑制 HEC 毒素的溶血活性,溶血抑制效价为1∶32～1∶256。用1B4和5E3两株细胞制备的腹水混合,建立了检测嗜水气单胞菌 HEC 毒素的点酶法。用单抗点酶法对95株临床病鱼分离菌进行检测,有72例阳性,敏感性较多抗点酶法高。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王莹 顾舒舒 何成华 王玉伟 任喆 施志玉 赵士侠 张海彬
从伏马菌素B1(FB1)杂交瘤细胞株F3中扩增出V H和V L基因片段,再经重叠延伸PCR(SOE-PCR)拼接扩增得到单链抗体(ScFv)基因,然后克隆到pCANTAB 5E噬菌粒载体上,转化感受态大肠杆菌TG1,并经辅助噬菌体M13K07超感染,构建FB1毒素噬菌体单链抗体库,ScFv基因插入率为100%,库容约为1.5×107,噬菌体的滴度为2.1×1015PFU·mL-1。免疫亲和筛选和富集后,经ELISA法最终筛选得到5株可分泌阳性噬菌体抗体的细菌。结论:伏马菌素B1噬菌体单链抗体库构建成功。
关键词：
伏马菌素B1 单链抗体 噬菌体抗体库
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李鑫 瞿波 廖玉才 李和平
根据抗玉米赤霉烯酮毒素单链抗体的氨基酸序列及大肠杆菌偏爱密码子,用重叠延伸PCR法合成了单链抗体的重链和轻链,经(Gly4Ser)2Linker连接,获得完整的单链抗体基因ZEN2 scFv。将ZEN2 scFv与碱性磷酸酶(AP)编码序列连接形成融合蛋白基因ZEN2 scFv-AP,构建到pET载体,转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),经IPTG诱导表达及亲和层析纯化,在SDS-PAGE和Western blot分析中均检测到1条分子质量为75 ku的可溶性蛋白条带,ELISA分析证实,细菌表达的ZEN2 scFv-AP融合蛋白具有碱性磷酸酶活性。这一研究结果为建立快速、灵敏、经济的玉米赤霉...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张涛 张丽丽 魏纪珍 肖玉涛 梁革梅 周瑞阳
【目的】通过比较Cry1Ac抗、感棉铃虫昆虫中肠碱性磷酸酶(ALP1)表达量的差异及抗性棉铃虫取食Cry1Ac蛋白对ALP1表达量的影响,分析ALP1表达量变化与抗性的关系,为进一步明确Bt抗性机制、制定抗性治理策略提供理论依据。【方法】利用实时荧光定量PCR技术,比较敏感棉铃虫、Cry1Ac抗性棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料和正常饲料后ALP1表达量的差异。【结果】ALP1在棉铃虫整个发育期都表达,幼虫的表达量最高,蛹期表达量最低,在成虫体内也有较高的表达;ALP1在幼虫中肠表达量最高,其次是后肠、前肠、马氏管,表皮中的表达量最低;与敏感品系相比,对Cry1Ac具有中等水平抗性的棉铃虫A...
关键词：
棉铃虫 Bt 抗性 碱性磷酸酶 表达量
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
陈琼 陆承平 陈怀青
用嗜水气单胞菌ＨＥＣ毒素免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，通过一次性杂交瘤融合，在筛选ＨＥＣ毒素单克隆抗体（ＭｃＡｂ１）的同时，用兔抗ＨＥＣ毒素血清（ＰＡｂ）包板的ＥＬＩＳＡ方法，筛选到两株抗ＨＥＣ毒素的单克隆抗独特型抗体（ＭｃＡｂ２）。两株ＭｃＡｂ２腹水ＥＬＩＳＡ效价分别为１：２０４８０和１：５１２０，属于ＩｇＧ１亚类。ＨＥＣ毒素的模拟抗原ＭｃＡｂ２不能溶解人的Ｏ型红细胞，但能与相应的ＰＡｂ反应，并能阻断ＰＡｂ与ＨＥＣ毒素的结合。将ＭｃＡｂ２连接到同源小鼠红细胞（ＭＲＢＣ）后免疫小鼠，用ＨＥＣ毒素包板的ＥＬＩＳＡ检测其血清，呈阳性结果，说明ＭｃＡｂ２能模拟ＨＥＣ刺激机体产生抗ＨＥＣ毒素的抗体（Ａｂ３）。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘雨芳 贺玲 汪琼 胡斯琴 刘文海 陈康贵
【目的】研究转基因抗虫水稻对稻田主要非靶标害虫的田间影响。【方法】以转cry1Ac/sck双基因抗虫水稻株系MSA、MSB、MSA4及其杂交稻21S/MSB、II-32A/MSB与KF6-304为材料,2002年在福建沙县、2003至2004在湖南湘潭县系统地开展了转基因水稻对稻田主要非靶标害虫白背飞虱、褐飞虱、叶蝉及稻瘿蚊的田间影响评价研究。【结果】秧苗期,MSA、MSB、21S/MSB、II-32A/MSB对稻飞虱产卵没有明显影响,稻飞虱在MSA4与KF6-304秧苗上的产卵量显著低于其对照,但所取样本上的产卵量都非常低。水稻移栽后,转基因水稻株系对白背飞虱与褐飞虱种群数量的影响有一定差异...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘祥
为探索铜绿假单胞菌ＥＴＡ蛋白的免疫保护功能，采用分子克隆方法获得铜绿假单胞菌ＥＴＡ表达菌株；利用切胶纯化获得ＥＴＡ蛋白并免疫小鼠，制备ＥＴＡ蛋白多克隆抗体；用ＥＬＩＳＡ方法，检测出ＥＴＡ抗血清滴度达１∶８ ０００；蛋白质印迹分析结果表明，抗血清具有很好的特异性；小鼠免疫保护试验结果表明，ＥＴＡ对铜绿假单胞菌感染的保护率达５０％，显著高于对照组的免疫保护率。用ＤＮＡｍＡＮ软件对ＥＴＡ序列同源性进行分析，发现革兰氏阴性菌的同源性高于革兰氏阳性菌，铜绿假单胞菌种间的同源性高于其他种类细菌的同源性；用ｍＥＧＡ软件对ＥＴＡ的进化分析结果表明，不同血清型铜绿假单胞菌的亲缘关系高于其他细菌，据此可推测ＥＴＡ．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
王宏华 侯竹美 张全启 于海洋 王志刚 齐洁 王旭波
为制备病毒性出血性败血症病毒（ＶＨＳＶ）单链抗体（Ｓｉｎｇｌｅ ｃＨａｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＳｃｆＶ）并鉴定其生物学功能，本研究提取抗ＶＨＳＶ单抗１ｇ５的杂交瘤细胞株总ｒｎａ并反转录获得ｃｄｎａ模板，通过Ｐｃｒ扩增ＶＨＳＶ抗体的轻链可变区（Ｖｌ）和重链可变区（ＶＨ）编码序列，将其拼接成单链抗体Ｓｃ ｆＶ基因后插入载体Ｐｅｔ２８ａ中，构建原核表达重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达。结果表明，单链抗体主要以可溶性形式表达，分子量约２８ ｋｕ，能特异性识别ＶＨＳＶ病毒的ｇ蛋白并对ＶＨＳＶ病毒具有体外中和活性，其对ＶＨＳＶ病毒的ｇ蛋白亲和力（ｋｄ）达到１．４×１０～（．．．
关键词：
鱼 病毒性出血性败血症病毒 单链抗体
[期刊] 华北农学报
[作者]
燕树锋 铁双贵 岳润清 韩小花 齐建双 卢彩霞
为将改造合成的抗虫基因（Ｃｒｙ１ＡＣ－ｗ）导入玉米基因组，以玉米杂交组合ＰＡ×ＰＢ的胚性愈伤组织为外植体，用双丙氨磷作为抗性愈伤组织的筛选剂，通过农杆菌介导法获得了８２个再生植株。经标记基因（ＢＡｒ）和目的基因（Ｃｒｙ１ＡＣ－ｗ）的ＰＣｒ检测，其中１９株为阳性，即为推断的转Ｃｒｙ１ＡＣ－ｗ基因抗虫玉米。对其中２株（ｗ１和ｗ２）进行目的基因单酶切的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，发现ｗ１和ｗ２分别为单位点和双位点插入，这也进一步证实目的基因已经整合入玉米基因组中。用Ｂｔ－Ｃｒｙ１ＡＢ／ＡＣ金标免疫试纸条进行蛋白质表达的检测，初步证实目标Ｃｒｙ１ＡＣ－ｗ蛋白在玉米中得到表达。
[期刊] 华北农学报
[作者]
燕树锋 铁双贵 岳润清 韩小花 齐建双 卢彩霞
为将改造合成的抗虫基因(Cry1Ac-w)导入玉米基因组,以玉米杂交组合PA×PB的胚性愈伤组织为外植体,用双丙氨磷作为抗性愈伤组织的筛选剂,通过农杆菌介导法获得了82个再生植株。经标记基因(bar)和目的基因(Cry1Ac-w)的PCR检测,其中19株为阳性,即为推断的转Cry1Ac-w基因抗虫玉米。对其中2株(w1和w2)进行目的基因单酶切的Southern杂交分析,发现w1和w2分别为单位点和双位点插入,这也进一步证实目的基因已经整合入玉米基因组中。用Bt-Cry1Ab/Ac金标免疫试纸条进行蛋白质表达的检测,初步证实目标Cry1Ac-w蛋白在玉米中得到表达。
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