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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周慧敏 牛家峰 池慧兵 马斌 朱萍 陆兆新 吕凤霞
[目的]呕吐毒素（DON）广泛存在于粮谷类原料及其制品中，对人和动物的健康都造成严重危害。然而，现有呕吐毒素解毒酶存在种类少、催化性能差等问题，限制了其在食品加工和饲料中的应用。本研究采用理性设计策略对呕吐毒素解毒酶DepB进行分子改造，以提高DepB的催化活性。[方法]通过对底物10 ?范围内的氨基酸残基进行丙氨酸和甘氨酸扫描，确定突变“热点”氨基酸残基。随后，采用定点饱和突变和组合突变技术筛选得到催化活性显著提高的突变酶，并对其进行三维结构模拟和分子动力学模拟，分析其催化活性提高的分子机制。[结果]获得了催化活性显著提高的三点突变酶A289V/A227R/S54N，该酶比活力为335.77 U·mg~(-1)，是野生型DepB的2.25倍。动力学参数显示，三点突变酶的K_(m)值由95.11 μmol·L~(-1)下降到58.33 μmol·L~(-1)，k_(cat)/K_(m)比值由5.99 mmol~(-1)·L·s~(-1)提高至16.94 mmol~(-1)·L·s~(-1)，亲和力和催化效率均显著提高。通过三维结构模拟和分子动力学模拟分析，发现空间位阻减小、静电相互作用增强、酶-底物-辅酶结合自由能降低是其催化活性提高的分子机制。[结论]基于理性设计策略提高了DepB的催化活性，强化了DepB的适用性能，为呕吐毒素解毒酶的分子改造及其在食品加工和饲料中的应用提供依据。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李越 池慧兵 牛家峰 马斌 周慧敏 朱萍 吕凤霞
[目的]呕吐毒素（deoxynivalenol，DON）C3位羟基的异构化是生物脱毒的关键部位，其中DepA作为DON生物转化中第一步关键限速酶，存在催化活性低的问题，限制了其在食品及饲料加工领域中的应用。本文旨在通过定向进化技术对DepA进行分子改造，以期获得催化活性显著提高的突变酶，提高其工业化应用的潜力。[方法]通过易错PCR和DNA shuffling相结合的方法，构建突变文库，经高通量筛选后，对催化活性明显提高的突变体进行酶学性质表征。同时，采用分子动力学模拟和三维结构模拟分析，探究突变酶催化活性提高的分子机制。[结果]成功筛选到突变酶S2、S10和S12，与野生型相比，比活力分别提高了207%、293%和268%。动力学参数结果显示，突变酶S2、S10和S12的K_(m)值分别为56.89、27.00和40.65 μmol·L~(-1)，是野生型的91.7%、43.5%和65.5%，k_(cat)/K_(m)值分别为327.30、576.67和380.07 L·mmol~(-1)·s~(-1)，是野生型的1.25、2.20和1.45倍，相比野生型，突变酶亲和力和催化效率均显著提高。此外，采用分子动力学模拟和三维结构模拟分析，发现柔性增加、底物DON的进攻距离缩短、氢键增加、疏水性增加和远端效应是导致其催化活性提高的主要原因。[结论]本研究通过易错PCR和DNA shuffling相结合的定向进化策略有效提高了呕吐毒素解毒酶DepA的催化活性，为其工业化应用提供依据。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李若楠 康瑞芬 沈丹 戴鹏远 唐倩 李春梅
[目的]本试验以猪空肠上皮细胞（IPEC-J2）为模型，探讨谷氨酰胺（Gln）对呕吐毒素（DON）诱导的IPEC-J2细胞凋亡和炎症的影响。[方法]通过MTT方法测定细胞活力来选择适宜的Gln浓度，以不添加Gln和DON的细胞为空白对照组，试验组分别为0.75 mmol·L~(-1) Gln组，2.0 μg·mL~(-1) DON组和2.0 μg·mL~(-1) DON+0.75 mmol·L~(-1) Gln组，处理24 h后测定各组细胞凋亡率、活性氧自由基（ROS）及细胞凋亡和炎症相关基因和蛋白的表达水平。[结果]与对照组相比，DON处理24 h显著升高细胞的凋亡比例和ROS含量(ROS荧光密度/细胞总数)（P<0.01）；与DON组相比，DON+Gln组显著降低细胞的凋亡比例和ROS含量（P<0.01）。与对照组相比，DON组上调了IPEC-J2细胞白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL–6）、环氧合酶2（COX–2）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）炎症相关基因和Caspase-3及Caspase-8凋亡相关基因的表达水平；与DON组相比，DON+Gln组下调了IPEC-J2细胞IL-1β、COX–2、Caspase-3、Caspase-8、BAK和Bcl-2基因的表达水平。蛋白免疫荧光结果显示，与对照组相比，DON组上调IPEC-J2细胞Caspase-3，核转录因子κB（NF-κB）和磷酸化核转录因子κB（phospho-NF-κB）蛋白的表达，而添加Gln后（DON+Gln组）下调了相关蛋白的表达。[结论]Gln通过清除DON诱导的IPEC-J2细胞中过量的ROS和调节炎症和凋亡相关基因及蛋白的表达量来缓解由DON引起的肠道上皮细胞损伤。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
黄伟 何慧禹 鲁鹏 陈翊平
为实现谷物中呕吐毒素（deoxynivalenol,DON）的快速、灵敏检测，采用生物传感和化学发光技术相结合的方式，研制应用于现场快速检测谷物中呕吐毒素的化学发光光纤免疫传感器，并搭建用于化学发光信号检测的便携式传感平台。整个检测平台集成到一个32 cm×15 cm×25 cm的黑色避光盒中，质量小于3 kg。结果显示：所研制的化学发光光纤免疫传感器在0.1～1 200 ng/mL呈现出良好的线性关系，检出限为62.7 pg/mL；功能化的光纤探针能够稳定保存30 d且具有良好的特异性和抗干扰性；其应用于谷物样品的呕吐毒素检测回收率为81.00%～107.33%，相对标准偏差小于8.69%。结果表明，该方法较ELISA法的灵敏度提高了30倍，线性范围拓宽了3个数量级，适合应用于谷物样品中呕吐毒素的现场快速检测。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李荣佳 李治忠 周闯 司慧民 吴文达 张海彬
[目的]评价一种新型吸附剂HG对黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)和呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)的吸附效果。[方法]以水合硅酸铝钠钙(HSCAS)为基础,配合葡甘露聚糖(GM),以合理配比制备成一种新型复合吸附剂HG,通过体外等温吸附试验、不同p H值下的吸附试验以及蛋雏鸡体内试验等,综合评价其吸附效果。[结果]HG对AFB1的吸附符合Langmuir方程,平均吸附率为90.24%;HG对DON的等温吸附则无规律,平均吸附率为28.08%。HG能够改善由霉变饲料引起的肝脏、肾脏、脾脏的肿胀,以及胸腺和法氏囊的萎缩,可将总蛋白、白蛋白含量和血清酶活性恢复至正...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐重新 金嘉凤 孙晓明 沈成 张霄 陈澄宇 刘贤金 刘媛
Bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白，其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治，产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕Bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点，特别是随着Bt毒素结构功能和作用机制日趋明晰，为其功能修饰和创新应用创造了条件，相关研究蓬勃发展，成效显著。大量研究表明，采用定点突变、结构域替换或融合以及抗独特型抗体模拟等策略，是理性设计活性更高、稳定性更强、杀虫谱更广、非靶标生物安全性更高甚至是可用于害虫抗药性治理的有别于母体Bt毒素的突变体、结构杂合体乃至功能效应物抗体等新型杀虫蛋白的有效手段；此外，采用催化毒素活化、驱动毒素靶向受体结合、促进毒素表达以及同源或异源杀虫材料复配或共表达的协同促效等创新增效策略，也是助推Bt毒素应用价值的重要手段。本文总结了Bt毒素结构功能和作用机制，梳理了基于Bt毒素功能修饰的突变体、结构杂合体以及功能效应物抗体等新型杀虫蛋白理性设计和基于Bt毒素功能增效的创新应用策略等相关研究进展，并结合作者团队在模拟Bt毒素杀虫功能效应物抗体靶向设计研发方面的最新成果，探讨了基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略未来发展动向及潜在可行捷径，为相关研究提供较为全面的最新有价值的文献资料和启发思路。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
荆雅玮 左佳坤 王志豪 胡剑刚 黄燕 米荣升 苗晋锋 温纳相 陈兆国 韩先干
#N/A
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王钦 李建林 唐永凯 李红霞 张磊 沈泽恩 俞菊华
[目的]本文旨在获得可溶的鲤鱼(Cyprinus carpio)groupⅢ分泌型磷脂酶A_2(PLA2g3a1)催化活性区(PLA_2 bee venom like region,PBVR)原核重组蛋白,并测定该蛋白的磷脂酶活性。[方法]分别构建标签蛋白小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)、硫氧还原蛋白(thioredoxin A,TrxA)、N利用物质A(N-utilization substance A,NusA)、麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)与PBVR的重组表达质粒,转化入大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)进行原核表达,比较不同标签蛋白的促溶作用;使用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,与BSA蛋白标准品电泳比对确定纯化后蛋白的浓度;采用偶联氧脂合酶法测定PBVR重组蛋白的磷脂酶活性。[结果]促溶作用最高的标签蛋白是NusA,可溶性重组蛋白占总蛋白的95%,其次是MBP和TrxA,分别占87%和47%。综合考量可溶性重组蛋白的得率,选择MBP融合蛋白。重组原核表达蛋白MBP-PBVR的磷脂酶比活力[(13.68±0.12)U·μmol~(-1)]显著高于TrxA-PBVR[(0.94±0.01)U·μmol~(-1)]和NusA-PBVR[(0.93±0.04)U·μmol~(-1)](P
[期刊] 林业科学
[作者]
鄢杰明 钟华 严俊鑫 严善春
为了研究多杀菌素对森林害虫舞毒蛾的杀虫活性,采用叶片药膜法测定多杀菌素对舞毒蛾3龄和5龄幼虫的生物活性及致死中量对其体内解毒酶活性的影响。结果表明:多杀菌素24h致死中浓度(LC50)分别为0.0249mg·L-1(3龄)和0.2269mg·L-1(5龄);致死中量多杀菌素对舞毒蛾3龄和5龄幼虫体内解毒酶存在不同程度的影响,其中对羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多功能氧化酶(MFO)和碱性磷酸酯酶(ALP)大体上均表现为先激活后抑制作用,差异显著(P<0.05);而对酸性磷酸酯酶表现为抑制-激活-抑制作用,差异极显著(P<0.01)。LC10和LC50剂量的多杀菌素对舞毒蛾...
关键词：
多杀菌素 舞毒蛾 解毒酶
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张超 王丕武 张卓
【目的】克隆大豆查尔酮还原酶3基因(chr3),并分析其编码蛋白体外催化活性,为研究大豆苷元的合成与调控研究提供参考。【方法】以大豆品种"吉农17"为材料,采用RACE技术扩增大豆chr3基因,对其编码蛋白的结构和功能位点进行分析。将目的基因chr3连接到大肠杆菌载体pET28a上,然后转化到大肠杆菌BL21中,构建重组大肠杆菌原核表达载体BL21-pET28a-chr3,并通过高效液相色谱技术(HPLC)验证重组蛋白的催化性质及效率。【结果】成功克隆chr3基因,其全长序列长1 416bp(GenBank登录号:KF927169),成功构建了大肠杆菌原核表达载体BL21-pET28a-chr...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
徐达 吴小卡 荆雅玮 左佳坤 米荣升 黄燕 陈兆国 王成明 韩先干
[目的]细菌的sah H基因编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(Sah H),该酶参与细菌的甲硫氨酸循环(AMC),调控细菌的多种生理功能。[方法]通过构建重组表达质粒p ET28a-Bru-sah H和p ET28a-Pse-sah H,分别表达布鲁菌(Brucella abortus)S2308株和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1株的Sah H重组蛋白Bru-Sah H和Pse-Sah H。将纯化后的Bru-Sah H、Pse-Sah H以及我们前期表达纯化的禽致病性大
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘祥英 李琼轩 柏连阳
以高压汞灯为光源,研究纳米二氧化钛(TiO2)降解毒死蜱的反应动力学,考察纳米TiO2用量、毒死蜱起始质量浓度及溶液pH值对毒死蜱光催化降解速率的影响。结果表明,纳米TiO2最佳用量为50～100 mg/L,毒死蜱初始质量浓度在5～80 mg/L时,其降解反应符合一级反应动力学规律,表现为毒死蜱质量浓度越大,降解速率常数越小,半衰期越长,毒死蜱质量浓度为80 mg/L的半衰期为27.18 min,比质量浓度5 mg/L时的长1.5倍;碱性条件有利于毒死蜱的降解。
关键词：
毒死蜱 光催化 纳米二氧化钛 动力学
[期刊] 实验技术与管理
[作者]
武华乙 金兰英 丁雯 张岚 简文杰
文章将科研课题"CNTs/Ag/AgBr材料的制备及光催化活性研究"引入本科生实验教学,采用简单的溶液法合成了CNTs/Ag/AgBr材料,利用X射线衍射、扫描电镜及紫外-可见分光光度仪等对材料进行了结构和光学性能表征,探究了材料在模拟太阳光下对RhB的降解性能。该实验涉及材料合成、催化反应及材料表征等方面知识,有助于锻炼学生分析和解决问题的能力,有助于激发学生的创新思维和提高学生的综合素养。
[期刊] 实验技术与管理
[作者]
刘瑞红 李义磊 李发堂
通过构建还原气氛以离子液体自燃烧一步合成了具有表面氧空位的BiOCl光催化剂,以X射线衍射、透射电镜等仪器对其进行了分析和表征,以可见光下罗丹明B的降解评价其催化活性,考察了燃料用量对其催化活性的影响。结果表明,以二乙胺盐酸盐为燃料和反应物,可以合成具有氧空位的BiOCl,其禁带宽度由无氧空位的3.15eV降低到2.72eV,可见光下罗丹明B 10min即可基本实现完全脱色。该实验涵盖纳米材料、光催化、燃烧合成、离子液体及测试表征等多个知识点,有利于提高学生综合能力和素质。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
李慧 严善春 王志英 葛士林 曹传旺
采用质量法和酶活性测定法研究了毒死蜱对舞毒蛾(Lymantria dispar)3龄幼虫食物利用的影响,并测定了其毒力及解毒酶、乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性。用亚致死浓度(1.5 mg.L-1)毒死蜱处理小黑杨叶片,饲喂舞毒蛾3龄幼虫,其幼虫生长率(RGR)、食物利用率(ECI)和食物转化率(ECD)均显著低于对照,而近似消化率(AD)显著高于对照,相对取食量(RCR)处理和对照间差异不显著。毒死蜱对舞毒蛾幼虫24 h致死中浓度(LC50)为5.86 mg.L-1,其毒力低于三氟氯氰菊酯而高于氧化乐果。毒死蜱对舞毒蛾3龄幼虫体内羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和AChE均...
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