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[期刊] 中国农业科学
[作者]
罗金 刘光远 田占成 谢俊仁
【目的】环形泰勒虫作为牛科动物重要的血液原虫对养牛业产生了重大危害。近年来针对该病原Tams1基因的诊断方法及候选疫苗筛选进行了大量工作。但研究证明该基因多态性对诊断及免疫效果存在影响。基于此,本研究对Tams1基因多态性特征进行了分析,并为该病的诊断建立一种实施有效的检测方法。【方法】参考GenBank中公布的环形泰勒虫Tams1基因的核苷酸序列,设计特异性引物。PCR扩增,获得了846 bp的核苷酸片段。将该基因片段与GenBank中主要的12种已知不同区域虫株的相应氨基酸序列进行比较分析。在保守区设计引物,以Tams1基因标准阳性质粒为模板建立环形泰勒虫病的二温式-PCR检测方法。经优化...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
葛晓敏 温丽翠 缪荣浩 李才善 刘凯强 陈宋琴 郑会珍 巴音查汗 郭庆勇
为了对新疆部分地区环形泰勒虫Tams1基因型及遗传多样性进行分析，本研究对新疆托克逊、艾丁湖、青河和伊吾地区奶牛血液DNA进行检测，采用PCR方法对Tams1基因扩增、克隆和测序，并进行序列比对。通过MEGA、DNAsp、NetNGlyc等软件及在线软件分析Tams1基因及其蛋白序列。结果显示：1)新疆地区23条环形泰勒虫序列除伊吾地区2号样品序列被归为G3型，其余均属于G1型；此外，新疆地区Tams1基因序列在核苷酸与氨基酸水平上分别具有90.1%～100%和83.9%～100%的相似性。2)Tams1序列在核苷酸的168～217和479～528位置之间可检测到广泛序列变异。通过Hd=0.994±0.006、π=0.071±0.002、S=178、h=38及k=52.32均显示Tams1序列较高的遗传多样性；中性指数结果显示当地环形泰勒虫Tams1基因单倍型数大于多态位点个数，遗传多样性呈平衡选择。3)Tams1蛋白的N末端显示出较大的序列变异性，在3个区域(氨基酸位置27～52、138～175和180～196)存在广泛变异。经B细胞抗原表位预测及3D结构同源建模，发现Tams1蛋白抗原位点多位于表面，其抗原性较好。综上，本研究发现本次备选采样点的环形泰勒虫具有较高的遗传多样性，该数据可为后续环形泰勒虫基因型和种群结构变化、不同致病特性及逃避宿主免疫机制等研究提供参考。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
范晴 谢芝勋 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤 谢丽基 彭宜
根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛轮状病毒(BRV)的保守基因设计了两对特异引物,并将三温式PCR扩增程序简化为2个温度梯度,建立了用于同时检测BVDV和BRV的二温式多重PCR方法,扩增长度分别为244和385 bp。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法只对BVDV和BRV模板进行扩增,而对其他对照病毒的检测均为阴性;检测灵敏度高,最低能检测到BVDV和RBV各1 pg病毒RNA。建立的BVDV和BRV二温式多重PCR方法,是一种快速、特异、敏感的检测方法。
[期刊] 华北农学报
[作者]
路斌 王一成 吴润 袁秀芳 徐丽华 李军星 王朝文
通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
扈鸿霞 马宇轩 王艳红 林峻 李占武 季荣
【目的】建立一种灵敏、快捷的检测蝗虫微孢子虫（Ｐａｒａｎｏｓｅｍａ ｌｏｃｕｓｔａｅ）的套式Ｐｃｒ方法，为运用微孢子虫防治蝗虫提供技术支持。【方法】以ＧｅｎＢａｎｋ数据库中公布的保守性高的微孢子虫小核糖体亚单位ｒｎａ为目的基因，采用Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ软件设计两对特异的套式Ｐｃｒ引物Ｐ．ｌ．－Ｆ１／Ｐ．ｌ．－ｒ１和Ｐ．ｌ．－Ｆ２／Ｐ．ｌ．－ｒ２，将微孢子虫液用０．２ ｍｏｌ·ｌ～（－１） ｋｏＨ处理后得到的发芽液作为模板进行Ｐｃｒ扩增，建立以Ｐ．ｌ．－Ｆ１／Ｐ．ｌ．－ｒ１为外侧引物、Ｐ．ｌ．－Ｆ２／Ｐ．ｌ．－ｒ２为内侧引物的套式Ｐｃｒ，扩增产为分别为２９８和２４２ ＢＰ。对引物浓度、退火温．．．
关键词：
蝗虫微孢子虫 套式PCR 检测
[期刊] 华北农学报
[作者]
李碧侠 赵芳 任守文 王学敏 方晓敏
SIRT1基因对细胞的生存、衰老、凋亡等生理活动起着十分重要的调节作用。为了建立荧光定量PCR技术检测猪SIRT1基因表达量,根据GenBank中猪SIRT1 mRNA序列设计引物,建立基于SYBR Green I染料技术的荧光定量PCR检测方法。结果表明,所建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、敏感和特异性强等特点,为猪SIRT1基因定量分析提供了技术平台。
关键词：
猪 SIRT1 荧光定量PCR
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
邱海芳 汪超 张庆德 刘榜
采用PCR-RFLP方法对通城、大白和长白3个纯种及长大通和大长通2个三元杂种共5个群体MyoD1基因第1内含子的多态性进行了研究,并对多态位点与生长、胴体和肉质性状进行了关联分析。结果发现第1内含子第257位存在1个A/C颠换,引起DdeⅠ酶切位点的改变。PCR产物经DdeⅠ酶切后,检测到2个等位基因,3种基因型,其中通城猪中C等位基因的分布占主要优势,大白、长白猪中2种等位基因的分布频率相近。关联分析结果表明,不同的基因型与肉色评分和失水率相关(P<0.05或P<0.01);CC基因型个体的肉色评分显著高于AA和AC基因型个体;而CC基因型个体的失水率极显著低于AA基因型个体。研究结果进一...
关键词：
猪 MyoD1基因 多态性 肉质性状
[期刊] 中国农业科学
[作者]
肖淑敏 李国清 李韦华 周荣琼 杨建伟
【目的】建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。【方法】根据牛源环孢子虫18S rDNA序列,设计1对保守引物和1对特异性引物,建立牛源环孢子虫套式PCR检测方法。通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件,进行特异性和敏感性试验。并对168份临床样品进行了检测。【结果】该套式PCR能特异性地扩增出牛源环孢子虫基因组DNA中相应片段,与艾美耳球虫、隐孢子虫、贾第虫等10种相关原虫基因组DNA无交叉反应;最低能检测到2.85×10-2fg的阳性参照DNA;对临床样品检测结果表明PCR技术检查阳性者显微镜检查都为阳性。【结论】建立的套式PCR方法具有高度的特异性和敏感性,有较好的临...
关键词：
环孢子虫 奶牛 套式PCR 检测
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李瀚 唐唯 郝大海 王培 李灿辉
分析细胞质遗传背景是马铃薯育种亲本选配和早世代选择工作的重点。以４个携带不同细胞质遗传背景的马铃薯栽培品种为实验材料，利用已开发的ｃｐＤＮＡ／ｍｔＤＮＡ多态性标记，建立了在一个ｐｃＲ反应体系中能同时鉴别不同细胞质遗传背景的多重ｐｃＲ扩增体系。结果表明：多重ｐｃＲ和单一ｐｃＲ扩增体系对马铃薯ｃｐＤＮＡ上４个位点（ＮＤｈ ｃ／ｔＲＮ Ｖ、Ｒｐｓ１６／ｔＲＮ Ｑ、１／１１Ａ、１０）和ｍｔＤＮＡ上位点ＢＡＮＤ １的扩增及经ＢＡｍ ｈ Ｉ酶切后的片段一致。用该体系鉴别大规模群体的细胞质遗传背景，可大大降低实验成本，节约时间、人力和物力，在马铃薯种质资源鉴定和分子标记辅助选育中具有重要的应用价值。
关键词：
多重PCR 细胞质遗传背景 马铃薯
[期刊] 西南农业学报
[作者]
何苹萍 赵永贞 陈秀荔 张彬 黄婷 彭敏 杨春玲 杨彦豪 李咏梅 邵朋威 陈晓汉
研究基于哈氏弧菌HSP60基因序列设计1对特异性引物,通过优化PCR条件,特异性及敏感性检测,建立了一套哈氏弧菌特异性PCR检测方法。结果表明,该PCR检测方法可使分离自患病南美白对虾的哈氏弧菌扩增出238 bp的HSP60基因片段,其他五种对照病原弧菌未扩增出任何条带;检测方法最低能检测出2.1 pg的哈氏弧菌基因组DNA。表明建立的哈氏弧菌PCR检测方法可用于该菌引起的水产动物疾病的快速诊断。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
卫波 景蕊莲 王成社 昌小平
【目的】以2份六倍体小麦Opata85和W7984及其重组近交系(RIL)的111个株系和3份小麦二倍体野生近缘种为材料,研究用等位基因特异PCR检测普通小麦中单核苷酸多态性的方法。【方法】利用直接测序的方法检测2份六倍体小麦和3份小麦二倍体野生近缘种TaDREB1基因的DNA序列,在B基因组上发现了2个SNPs。以其为3′端,设计等位基因特异引物及其互补引物,对SNP进行分型,同时研究了特异引物3′端碱基错配对等位基因特异PCR的影响,优化了PCR反应体系。【结果】等位基因特异引物3′端不同位置的碱基错配及不同类型的碱基错配对PCR结果影响较大;在等位基因特异PCR中,Mg2+、dNTP及T...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
曾东 肖拉 倪学勤
根据Gen Bank上的基因序列,在保守区设定并合成特异性引物,选择β–actin作为内参基因,采用SYBR Green I染料法,进行熔解曲线分析和标准曲线的制作。熔解曲线表明,β–actin、IL–1β、IL–8的基因产物均为特异性产物,其Tm值分别为86、82.5和84℃;标准曲线表明,各基因Ct值的检测范围为12~32,扩增效率分别为96.3%,103.2%和102.6%,具有良好的线性关系,且r2均大于0.990;组内变异系数分别为0.14%~0.86%,0.18%~0.93%和0.13%~0.86%;用建立的方法检测健康建鲤头、肾组织中IL–1β、IL–8的表达情况,相对表达量分别...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
陈观水 潘大仁 周以飞 林生 高丽华 杨志伟
为进一步研究甘薯病原微生物的侵染对甘薯病程相关非表达子1基因(NPR1)表达的影响,以甘薯肌动蛋白(β-ac-tin)基因为内参照基因,提取甘薯叶片总RNA,反转录为cDNA,同批异管对该2个基因进行PCR扩增.通过对循环数的优化和对体系重复性、准确性的分析,建立了一个稳定、方便的半定量RT-PCR体系.
[期刊] 中国水产科学
[作者]
杨坤 高志鹏 习丙文 陈凯 谢骏 潘良坤
在异育银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch)养殖过程中，因感染洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)引起的“喉孢子虫病”常会导致池塘养殖苗种和成鱼大量死亡。因此，建立一种特异性强、灵敏度高和易于操作的检测方法对于该病的早期诊断以及防治具有重要意义。本研究基于洪湖碘泡虫18S rDNA基因序列设计合成两组特异性引物，通过外引物组和单条内引物组合及条件优化，建立了洪湖碘泡虫单管半巢式PCR检测方法，并对该方法的特异性、灵敏度及临床应用分别进行了验证。结果显示，该检测方法特异性好，只有洪湖碘泡虫扩增为阳性，瓶囊碘泡虫(Myxobolus ampullicapsulatus)、吴李碘泡虫(Myxobolus wulii)、武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensis)及异育银鲫肌肉样品等均为阴性；最低检测灵敏度极限为4.2 copy/μL；对疫区养殖池塘健康异育银鲫的卵巢、肾脏及脾脏组织样品检测发现洪湖碘泡虫阳性率分别为40%、32%和8%，检出率显著高于普通PCR。因此，本研究所建立的检测方法特异性强、灵敏度高，可应用于洪湖碘泡虫的早期快速检测。
关键词：
异育银鲫 洪湖碘泡虫 PCR 喉孢子虫病
[期刊] 水产学报
[作者]
高文辉 白昌明 蔡生力 王崇明
为了建立适用于Ｏｓ ＨＶ－１不同变异株的检测方法，在牡蛎疱疹病毒（Ｏｓ ＨＶ－１）３个变异株全基因组序列比对的基础上，筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的ＤＮＡ聚合酶（ＤＮＡ ｐＯｌｙｍｅｒＡｓｅ）基因，据此设计巢式ｐＣｒ引物，优化ｐＣｒ反应体系和条件，建立了基于Ｏｓ ＨＶ－１ ＤＮＡ聚合酶基因的巢氏ｐＣｒ检测方法（ｐ－Ｎ ｐＣｒ检测方法），利用ｐ－Ｎ ｐＣｒ与ＣＮ ｐＣｒ检测方法对不同年份和宿主来源的Ｏｓ ＨＶ－１疑似感染样本进行检测。结果显示，ｐＮ ｐＣｒ检测方法能稳定地检出１００拷贝／μｌ的病毒ＤＮＡ；ｐ－Ｎ ｐＣｒ较Ｃ－Ｎ ｐＣｒ检测方法具有更强的特异性和更高的检出率。研究表明，本研究．．．
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