[目的]建立一种快速、准确的检测瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为诊断和防治瓜果腐霉菌引起的植物病害提供技术支撑。[方法]通过比较基因组学方法,在瓜果腐霉菌基因组上筛选有序列特异性的基因作为检测的靶标基因,设计LAMP特异性引物,建立一种基于颜色判定的快速、准确的LAMP检测方法,随后对该检测方法的特异性、灵敏度和发病组织实际检测等进行分析评价。[结果]鉴定到1个编码T

应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了基于颜色判定的简单、快速和灵敏的橡树疫霉菌(Phytophthora ramorum)检测方法。以ITS为靶序列对橡树疫霉菌的分子检测存在无法区分近似种的问题,笔者在橡树疫霉菌的基因组研究中,发现了PrA3aPro类转座子序列。生物信息学分析表明,该序列非常适合作为大豆疫霉分子检测的靶标。利用LAMP技术,以PrA3aPro为靶序列,设计LAMP特异性引物,建立LAMP反应体系与条件,并进行灵敏度和特异性试验。结果表明:整个检测过程仅需1 h,即可通过肉眼直接目测试验结果。...

[目的]应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立基于颜色判定的简便、快速和灵敏的大豆茎褐腐病菌[Phialophora gregata f.sp.sojae(PGS)]检测方法。[方法]利用LAMP技术,以ITS为靶序列,设计了4条特异性的LAMP引物和2条环引物,在此基础上建立了检测大豆茎褐腐病菌的LAMP体系。[结果]整个检测过程仅需1 h就可通过肉眼直接目测试验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化可以判断PGS的存在与否。...

［目的］黑白轮枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏ－ａｔｒｕｍ）能够危害苜蓿等多种作物，是我国重要的检疫性病原真菌。我们基于环介导等温扩增技术（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｌａｍｐ），建立基于颜色判定的简单、快速和灵敏的黑白轮枝菌检测方法。［方法］基于ｌａｍｐ技术，通过比对分析黑白轮枝菌与其相似种不同靶标序列间的差异，选取ｔｕｂ（β－ｔｕｂｌｉｎ，编码β－微管蛋白）基因作为靶标基因，设计并筛选了４条特异性强、灵敏度高的ｌａｍｐ引物和１条环引物，在此基础上建立了检测黑白轮枝菌的ｌａｍｐ体系，并进行特异性、灵敏度试验及田间发病组织的检测。该方法．．．

【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌（ＡｓｃｏｓｐｈＡｅｒＡ Ａｐｉｓ）的环介导等温扩增（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉＡｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍＡｌ ＡｍｐｌｉｆｉｃＡｔｉｏｎ，ｌＡｍｐ）方法，为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。［方法］根据蜜蜂球囊菌特异性序列ｉｔｓ区，用在线引物设计软件ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ４．０设计并合成４条特异性引物Ａ．Ａｐｉｓ－ｆ３（５＇－ＡｃＡｔｔＧｃＧｃｃｃｔｃｔＧＧｔＡ－３＇）、Ａ．Ａｐｉｓ－Ｂ３（５＇－ｔＧＧｔｔＡＧＡｃｃＧＧＡｃＡＧｔｃＧ－３＇）、Ａ．Ａｐｉｓ－ｆｉｐ（５＇－ｔＡＡＧＡｃＧＧＧＡｃＧＡｔｃＧｃｃｃ ＡＡｃｃｔＧｔｃｃＧＡＧｃＧｔｃＡｔｔ．．．

为快速鉴定Fusarium oxysporumf.sp.fragariae(Fof)引起的草莓枯萎病,主要采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了Fof的快速检测体系,使用组织分离法和PCR法对LAMP技术辅佐验证。结果表明:25μL体系中添加Buffer 2.50μL、Mg~(2+)(100 mmol/L)0.25μL、dNTPs(10mmol/L)1.00μL、FIP和BIP(20μmol/L)各1.00μL、F3和B3(10μmol/L)各0.50μL、LoopF(10μmol/L)0.75μL、Bst DNA聚合酶(8U/μL)0.50μL、Betaine(5mol/L)1.00μL、DNA模板1.00μL和ddH_2O 15.00μL,反应结束后添加0.40μL的SYBR Green Ⅰ染料为最佳反应体系;该体系最适反应温度为62.9℃,最佳反应时间为60min;特异性试验表明该体系能从16种草莓常见病原菌中特异性检测出Fof,最低检出限为45pg/μL,比常规PCR检测效率高;随机抽取田间病害样品16株,采用LAMP体系检测罹病草莓根茎中的病原菌,其中12株感病草莓的病原菌为Fof,使用组织分离法和PCR法验证了LAMP检测结果的准确性;传统病原菌鉴定耗时约5～7d,而LAMP检测1d内便可完成。综上,本研究建立的LAMP检测体系为Fof准确快速检测及实际应用奠定了基础。

［目的］通过对黄淮地区大豆种子带菌的快速检测，了解该地区大豆种子携带病原菌的情况。［方法］采用环介导等温扩增技术（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｌａｍｐ）检测黄淮地区２９个大豆主栽品种种子上平头炭疽菌、胶孢炭疽菌、尖镰孢菌、木贼镰孢菌、层出镰孢菌、黄色镰孢菌、禾谷镰孢菌、茄腐镰孢菌、大豆拟茎点种腐病菌、立枯丝核菌、大豆炭腐病菌、冬青丽赤壳菌、大豆疫霉病菌等大豆主要病原菌的携带情况。［结果］供试的２９个品种中有２０个品种的种子样本检出携带上述病原菌，分别携带所检测的１３种病原菌中的７种，检出率由高到低依次为平头炭疽菌、大豆拟茎点种腐病菌、木贼镰孢菌．．．

[目的]传统的以ITS(内转录间隔区)为靶序列对大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora,DPC)的分子检测无法区分大豆南方茎溃疡病菌(D.phaseolorum var.meridionalis)和大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla)等近似种。笔者在大豆北方茎溃疡病菌靶标序列筛选中,发现了翻译延伸因子(translation elongation factor 1α,tef1α)序列。通过目标病原菌与其相似种比对发现,大豆北方茎溃疡病菌在tef1α序列上有很好的特异性,适合作为分子检测的靶标。[方法]基于环介导等温扩...

【目的】空肠弯曲菌是一种重要的人畜共患病致病菌,主要经被污染的水源、乳制品、生禽肉进行传播,建立快速、准确的诊断方法是防控空肠弯曲菌感染的重要措施。【方法】本文引入一种新型的核酸检测技术——DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以空肠弯曲菌ORF-C序列为检测靶基因,建立了空肠弯曲菌LAMP快速检测方法。【结果】利用本LAMP方法对21种病原菌进行检测,仅空肠弯曲菌为阳性结果,说明该方法具有高度的特异性。该LAMP方法对空肠弯曲菌纯培养菌的检测灵敏度达6CFU/反应管,对污染材料中空肠弯曲菌的检测灵敏度为9CFU/反应管...

首先根据空肠弯曲菌mapA基因序列设计LAMP引物,建立检测空肠弯曲菌的LAMP检测方法。继而对LAMP方法中不同反应组分的浓度分别进行筛选,结果显示,当内外引物浓度分别为1.6,0.2μmol/L、Mg2+浓度为8mmol/L、dNTP浓度为1.4 mmol/L、Betaine浓度为0.8 mol/L时获得最佳的反应结果。最后对LAMP反应的特异性和敏感性进行检测,特异性检测结果显示,对其他13种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌扩增结果均为阴性;敏感性检测结果显示,对空肠弯曲菌基因组DNA的检测限为每个反应管100 fg,对空肠弯曲菌培养菌液检测限为每个反应管7.5cfu。试验建立的LAMP方法为...

【背景】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)侵染引起的一种柑橘病害。对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联防联控柑橘木虱等。前3种方法都需要依靠准确的柑橘黄龙病诊断技术。【目的】利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),结合膜吸附法DNA快速提取和Gelgreen荧光染料可视化,建立黄龙病田间核酸快速检测方法。【方法】以黄龙病菌β-操纵子与原噬菌体DNA聚合酶基因为模板设计LAMP特异性引物,包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LoopF/LoopB和茎引物StemF/StemB。通过对环引物和茎引物设定不同的用量组合,对LAMP引物体系进行优化,确定合适的引物浓度。用优化后的LAMP引物体系对188份田间柑橘叶片进行检测,并构建受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析实时荧光LAMP(qLAMP)在CLas检测上的准确性。对qLAMP预混反应液进行两步的常温干燥,分别设定不同的存放条件,评估LAMP常温干燥试剂的稳定性。用本研究建立的CLas可视化LAMP快速检测方法,对田间71个柑橘叶片样品和35个柑橘果实样品进行检测,与实时荧光定量PCR(qPCR)比较两者的符合率。【结果】在LAMP体系中加入环引物、茎引物或增加其浓度都能促进反应速率的提升,并且同时加入终浓度均为1.6μmol·L-1的环引物和茎引物能进一步提高LAMP反应速率。LAMP预混液通过两步法干燥在不同温度存放1—4周均能保持反应活性基本不变,表明制备的两步法干燥LAMP试剂检测性能较好,在低温和常温环境下的稳定性尚可,仅35℃高温存放会略微增加LAMP试剂的反应时间。使用孔径0.1μm尼龙膜代替纤维素滤纸作为核酸吸附材料能提升CLas快速诊断技术的灵敏度。结合DNA快速提取和可视化LAMP建立的CLas快速核酸诊断方法最低能检测到浓度为102 copies/μL的重组质粒样品,总体准确率高。经配对卡方检验,该方法的诊断结果与qPCR无显著差异。可视化LAMP快速检测相较常规检测有着更低的成本和耗时,而且可视化LAMP快速检测无需离心机和PCR仪等昂贵的仪器,仅需一台65℃恒温设备即可。【结论】建立的CLas快速核酸检测方法成本低,30 min即可观察到检测结果,操作简便,准确性高,可替代qPCR在田间进行黄龙病的快速鉴定。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在等温条件(60~65℃)下60 min左右进行核酸扩增,其扩增效率可达到109~1010个数量级,具有特异性强、灵敏度高、等温、操作简单和检测结果快速等优点。该技术已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫、菌物等病原物的检测中,在人、畜和植物病原生物的快速检测和病害诊断等领域具有广阔的应用前景。本文对LAMP技术原理及其在病原物检测中的应用做了简要综述,并对LAMP技术的应用前景进行了展望。

【目的】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。本研究拟用该技术建立菊花中番茄不孕病毒(TAV)的检测方法。【方法】设计能识别TAV CP序列6个特定区域的4种LAMP特异引物,对MgCl2、dNTPs、甜菜碱等LAMP反应条件进行优化,利用新建的LAMP法检测TAV,比较LAMP和RT-PCR2种不同方法的检测灵敏度。【结果】建立了检测番茄不孕病毒的LAMP技术;LAMP比RT-PCR具有灵敏度更高、快速、简便等优点。【结论】建立的LAMP技术能快速、准确、简便地检测出菊花中的番茄不孕病...

针对烟草青枯病的防控,开发快速、高效的病原菌检测方法是必要的。环式等温扩增(LAMP)是一种在等温条件下快速完成靶标基因扩增的新方法。将青枯病菌贵州分离株FQY4基因组序列(NCBI号:CP004013)与其他已发表菌株序列比对分析,确定编码鞭毛蛋白的fliC基因的保守区域可被选作检测靶标。根据LAMP原理以及靶标序列的特点,设计了一组由6条引物组成的环式等温扩增反应体系。结果表明:61℃条件下孵育45min,可完成对青枯病病原菌单菌落和带菌烟草叶片的检测,结果判定可以通过颜色变化被肉眼直接识别,也可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。通过这种新方法,可以实现对青枯病菌菌落的快速鉴别,还可以用于对田间疑...

根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因保守序列,利用Primer Explorerv 4.0软件设计了4条引物,建立了白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法,对反应温度和反应时间等参数进行了优化,同时将建立的LAMP检测方法与巢式PCR进行了比较分析。结果表明,LAMP最适反应在64℃恒温条件60min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色的阳性结果明显区别于橙色阴性结果。LAMP方法的最低检出限为100拷贝/μL,灵敏度较巢式PCR高100倍,而且LAMP方法在1h内即可完成检测,操作简单,无需复杂仪器,肉眼可直接观察检测结果。...