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[期刊] 西南农业学报
[作者]
贾定洪 李小林 周洁 彭卫红 谭伟 黄忠乾 甘炳成
【目的】构建毛木耳农杆菌介导转化双元表达载体,为毛木耳后续多功能纤维素酶基因Mfc转化研究奠定基础。【方法】通过EcoR I酶切p PK2质粒并回收大片段,应用实验设计引物分别对扩增毛木耳Gpd启动子、Mfcsg基因、intron、Hpt基因,通过无缝克隆方法,将p PK2质粒大片段与表达序列同源组装,分别构建农杆菌转化载体pAKMFC、pAKIMFC。【结果】测序验证发现各个元件都已在改造后的载体中进行了正确组装,符合实验预期。【结论】本实验通过毛木耳Gpd启动子、Mfcsg、Hpt潮霉素B抗性基因和终止子组装,构建形成了能够应用于毛木耳农杆菌介导转化的多功能纤维素酶基因双元表达质粒p AKMFC和p AKIMFC,为多功能纤维素酶Mfcsg基因转化增强毛木耳纤维素降解能力奠定了基础。
关键词：
无缝克隆 多功能纤维素酶 双元表达质粒
[期刊] 西南农业学报
[作者]
贾定洪 王波 李小林 谭伟 彭卫红
【目的】克隆福寿螺多功能纤维素酶基因(multi-functional cellulase gene,Mfc),进行密码子优化改造,便于后续毛木耳Mfc基因转导研究。【方法】采用Codon W软件分析福寿螺多功能纤维素酶基因Mfc及毛木耳转录本CDS密码子使用次数和同义密码子相对使用度差异,以毛木耳CDS密码子特征对福寿螺Mfc基因进行密码子优化。【结果】改造后的Mfcsg序列GC含量从原始Mfc序列的54.04%增加到58.16%,与毛木耳遗传背景一致。【结论】实验优化后获得的Mfcsg基因序列GC含量
关键词：
福寿螺 毛木耳 密码子优化
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
臧超群 白元俊 宋飞 谢瑾卉 林英 梁春浩
由卵菌引起的植物病害大多难以控制,常因再侵染次数多,暴发流行而导致严重损失。卵菌细胞壁的主要成分为纤维素,因此具有产生纤维素酶能力的生防菌能够更好的用于防治卵菌门真菌引起的植物病害。SY286菌株对葡萄霜霉病菌具有较强抑制活性。纤维素酶活性检测试验结果显示,SY286菌株代谢产物中含纤维素酶,菌落周围透明带宽度达5.9mm。根据已报道的纤维素酶基因序列设计引物,经聚合酶链式反应(PCR)扩增得到了561bp纤维素酶基因相关片段,经Blast比对,该与内切β~(-1),4-葡聚糖酶基因序列相似性达99%,即为SY286基因的核心序列。根据此片段的序列设计特异性引物,通过交错式热不对称PCR(TailPCR)得到其上下游序列,经拼接获得完整的纤维素酶基因的开放阅读框(ORF)序列(命名为SY286基因)。该基因序列ORF长度为1494 bp,编码1个含497个氨基酸的蛋白质,预测其蛋白分子量为55.04k Da,理论等电点PI为8.12。经Blast比对,该序列与内切β~(-1),4-葡聚糖酶编码序列相似性达99%,确定SY286基因为内切β~(-1),4-葡聚糖酶基因。并利用SDS-PAGE电泳对该蛋白在E.coli BL21(DE3)中的表达结果进行了检测。经0.5mmol·L~(-1)的IPTG诱导下,重组菌在15℃、22℃、30℃和37℃条件下的表达产物均可在PAGE凝胶上出现特异性条带。经检测重组菌具有纤维素酶活性。试验结果为研究纤维素酶在植物病害生物防治中的应用,以及SY286菌株抑菌分子机理研究和菌株的遗传改良奠定了基础。
关键词：
苍白杆菌 纤维素酶 克隆 表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
黄妙容 刘德武 吴珍芳
【目的】克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx,并在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行表达分析。【方法】通过RT-PCR的方法,从福寿螺胃组织总RNA中克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx序列,连接克隆载体pMD18-T,再通过Eco RⅠ和NotⅠ两个酶切位点分别与表达载体pET-32a(+)及pcDNA3.1(+)连接,构建原核、真核表达载体,并在E.coli BL-21(DE3)和猪肾细胞PK15中进行表达,最后采用DNS法测定表达产物酶学活性。【结果】RT-PCR扩增得到1 326 bp的序列,包括1 185 bp的编码序列和部分侧翼序列,编码序列与已报道的福寿螺多功能纤维素酶基因cDNA序列相似...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
刘海艳 白龙 赵海波 杨明明 曹斌云
为寻找新纤维素酶和纤维素酶基因资源,以羧甲基纤维素钠(CMC)改良的BHM培养基筛选菌株,经初筛和复筛筛选出目的菌株后,采用革兰氏染色法和16SrDNA基因片段比对法对筛选出的菌株进行鉴定;设计引物对P扩增其纤维素酶基因,连于pET-28a(+)载体构建原核表达载体并转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,表达结果采用SDS-PAGE和测定表达产物活性的方法来检验。结果显示,本研究成功筛选出一株新的具有较高纤维素酶活的短小芽孢杆菌BY-1,该菌所产纤维素酶具有较好的热稳定性和酸碱稳定性,最适宜温度和pH分别为55℃和7.45,在此条件下最高酶活性为0.921 6μmol/(mL.min);此外...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
魏晓骁 王士亚 陈潇潇 汪凤林 曹光球 曹世江
为探索杉木木材形成的分子机制,以杉木嫩叶总RNA反转录的c DNA为模板,运用RT-PCR技术克隆出一个新杉木纤维素合酶基因ClCesA.该基因的开放阅读框(ORF)为2 955 bp,共编码984个氨基酸.通过TMHMM Server v.2.0和MEGA5.1软件预测ClCesA蛋白的跨膜结构和功能,发现该蛋白N端含有锌指结构,共有8个跨膜结构,平均跨膜区域18个氨基酸残基,并具有保守的DDDQXXLRW结构域.系统进化树分析结果表明,ClCesA可能与细胞次生壁形成有关.荧光定量PCR分析表明,Cl
[期刊] 林业科学
[作者]
李春秀 齐力旺 史胜青 汪阳东 王建华 张守攻
克隆毛白杨纤维素合酶基因(PtoCesA1),全长为3215bp,与欧洲颤杨的PtrCesA1基因的同源性为97%,具有开放的阅读框,编码区在52~2988碱基之间,为2937bp。构建PtoCesA1基因的全长正义植物表达载体为pBIPA1,经酶切和PCR鉴定确认载体构建正确。通过农杆菌介导的方法将pBIPA1表达载体转入烟草中,转基因植株的纤维细胞壁厚度和木质部厚度都有不同程度的下降,形态表征为植株明显变矮,叶片变小。
关键词：
毛白杨 纤维素合酶基因 遗传转化
[期刊] 草业科学
[作者]
邹爱爱 魏亚琴 杨宇泽 曹磊 孙康永杰 万学瑞 王川
为构建高效表达的内切葡聚糖酶基因工程菌,本研究以牛瘤胃液中微生物全基因组为模板,通过PCR扩增方法得到eg片段,将其克隆至表达载体pMG36e中获得分泌型表达载体pMG36e::eg;将测序正确后的重组质粒电转导到乳酸菌(Lactococcus lactis NZ9000)中,得到L. lactis NZ9000/pMG36e::eg重组菌株,将发酵上清液通过10%三氯乙酸(Trichloroacetic acid, TCA)/丙酮沉淀法浓缩蛋白后,用刚果红染色法和3, 5-二硝基水杨酸(3, 5-Dinitrosalicylic acid, DNS)法检测该蛋白酶活性,使用滤纸酶活力(filter paper enzyme activity, FPA)法检测该蛋白酶的总酶活,并对重组内切葡聚糖酶进行酶学性质研究。结果表明:从牛瘤胃微生物中克隆得到一个基因大小为1 500 bp左右的条带,该酶分子量为50 kDa左右,经刚果红染色有明显水解圈,水解圈直径为2.32 cm;采用DNS法测定该重组蛋白的酶活为12.401 9U·mL~(-1),用FPA法测定总酶活为12.246 9 U·mL~(-1);重组蛋白酶对羧甲基纤维素钠、滤纸、微晶纤维素、脱脂棉均有酶活性;最适反应温度为90℃;最适反应pH为6;其中Cu~(2+)、Mn~(2+)、Ba~(2+)、Zn~(2+)、Co~(2+)等均可以提高重组酶的酶活力,而Fe~(2+)可抑制重组内切葡聚糖酶活力。本试验纤维素酶eg基因在L. lactis NZ9000中的稳定高效表达为提高青贮饲料的营养价值和消化率提供了技术支持。
[期刊] 华北农学报
[作者]
谢凤行 张峰峰 周可 赵玉洁 刘韵娅
采用紫外诱变、化学诱变(DES诱变)及复合诱变的方法对产纤维素酶枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B6的原生质体进行诱变,选育出10个高纤维酶活突变株。摇瓶发酵试验结果表明,所选突变株酶活都显著高于B6,其中,紫外诱变处理的突变株Z12,化学诱变得到的突变株H1以及复合诱变处理的突变株F12的产酶能力相对较强,且产酶能力稳定,酶活值分别为448.3,450.9,491.8U/mL,分别为对照的176%,178%,194%。试验结果说明,对枯草芽孢杆菌的原生质进行诱变可以提高菌株产纤维素酶的能力,而原生质体的复合诱变可提高诱变效应。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
任大明 毕霏 陈红漫 阚国仕 马艳 李艳秋 于可济
绿色木霉(Trichoderma viride)所产生纤维素酶可将秸秆天然纤维素组分转化为可发酵的糖,不仅对废物进行再利用,还可以减少环境污染。以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106总RNA为模板,利用RT-PCR技术反转录合成外切葡聚糖水解酶(CBHI)基因约1545bp的cDNA片段。该序列与GenBank中的cbhI E00389序列比较,氨基酸序列同源性达91%。大肠杆菌BL21原核表达和SDS-PAGE结果表明,重组蛋白分子量约为53kDa,重组酶活力为5.3U.mg-1。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨婷 裴雁曦 王景雪
以液体PDA中培养的香菇菌丝体为材料,提取香菇总RNA,通过RT-PCR方法,克隆得到纤维素酶基因cel6B,并成功构建了原核表达载体pET28a-cel6B;将该载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建工程菌,用IPTG诱导蛋白质的表达。SDS-PAGE电泳结果表明:在IPTG诱导下,cel6B基因编码出46.4 kDa的蛋白质CEL6B。将工程菌在CMC-Na(羧甲基纤维素钠)为唯一碳源的刚果红液体培养基中培养7 d后,培养基红色变浅,初步证明纤维素酶CEL6B具有分解纤维素的能力。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李今煜 肖水华 黄天培
以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游2个片段,以含有卡那霉素抗性基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含待敲除NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游片段、卡那霉素抗性基因的重组质粒pRN5101DKU,为后续Bt8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的敲除做准备.
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘轶儒 徐菲菲 钱国良 范加勤 胡白石 刘凤权
为探索基因rpfG在产酶溶杆菌中的功能,以产酶溶杆菌OH11为研究对象,在基因组测序的基础上,通过同源比对,在OH11基因组中鉴定出rpfG的同源基因,并命名为rpfGLys。利用同源重组技术,对rpfG基因进行了定向敲除,获得了rpfG的缺失突变株。与野生型相比,rpfG基因的突变降低了产酶溶杆菌重要抗菌物质———热稳定抗菌因子HSAF的产量和对腐霉的拮抗活性。荧光定量PCR显示,在rpfG突变株中负责生物合成HSAF的关键基因Lysegl002651的表达显著下调,与HSAF活性检测结果相吻合。然而,rpfG的突变不改变产酶溶杆菌4种胞外抗菌水解酶的活性。另外,rpfG突变导致产酶溶杆菌菌...
[期刊] 林业科学
[作者]
陈亚娟 王宏芝 李瑞芬 张中保 崔莉洁 魏建华
从毛白杨中分离7个纤维素合酶基因,分别为PtoCesA4,PtoCesA5,PtoCesA7,PtoCesA8,PtoCesA13,PtoCesA17和PtoCesA18,通过与已公布的毛果杨全基因序列及拟南芥和水稻基因组中纤维素合酶基因序列的同源性比对分析,结合目前纤维素合成机制的研究进展,预测毛白杨中上述不同纤维素合酶的功能。利用GenomeLabTMGeXP遗传分析系统分析毛白杨中纤维素合酶基因在不同组织中的转录表达水平,结果表明PtoCesA4,PtoCesA7,PtoCesA8,PtoCesA17和PtoCesA18在木质部高丰度表达,推测这些基因可能参与毛白杨次生细胞壁的形成,为毛...
关键词：
毛白杨 纤维素合酶 GeXP 基因表达
[期刊] 林业科学
[作者]
徐煲铧 杨晓慧 李百炼 张志毅 张德强
组合利用生物信息学和RT-PCR方法,首次从毛白杨未成熟木质部cDNA中分离出PtCesA4cDNA全长,并进行测序和序列分析,结果表明克隆的毛白杨PtCesA4 cDNA片段总长为3757bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为3129bp,可编码长度为1042个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtCesA4、水稻OsCesA1和火炬松PtCesA2的蛋白质氨基酸序列同源性分别为80.3%,78.9%和75.6%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtCesA4基因在杨树根、茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PtCesA4在成熟叶片、未成...
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