禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是真菌性玉米茎基腐病的主要致病菌之一,为了减少种子带菌对该病害的传播,本研究采用巢式PCR技术构建玉米种子检测体系,并对其进行特异性、灵敏度和可行性检测。结果表明,该体系可有效检测到玉米(Zea mays)种子携带禾谷镰刀菌的情况,灵敏度达4.224 pg·μL-1,是一种快速、灵敏、特异性强的检测体系,为玉米茎基腐病种子带菌检测、早期诊断和及时防治提供技术支持和理论依据。本研究是运用巢式PCR技术检测玉米茎基腐病主要致病菌-禾谷镰刀菌在国内的首次报道。

【目的】建立巢式PCR方法，快速检测处于病害潜育期的玉米叶片内的多堆柄锈菌（Puccinia polysora），为玉米南方锈病（southern corn rust）的预测和防治提供技术支持。【方法】根据多堆柄锈菌ITS区序列，在其变异区设计3条多堆柄锈菌特异性检测引物NX471-F、NX255-F和NX255-R，建立以NX471-F与真菌ITS区通用引物ITS4为外侧引物，NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR。采用20μL扩增体系：Ex Taq DNA聚合酶（5 U·μL~(-1))0.15μL、10×Ex Taq Buffer(Mg~(2+)plus)2μL,d NTP Mixture（各2.5 mmol·L~(-1))1.6μL，上下游引物（10μmol·L~(-1)）各0.3μL,DNA 1μL,14.65μL ddH_2O。扩增程序：利用外侧引物NX471-F/ITS4进行第一步PCR扩增，95℃预变性7 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30个循环；72℃再延伸7 min。将扩增后的产物稀释20倍，取1μL用作第二步PCR的扩增模板，然后以内侧引物NX255-F/NX255-R进行第二步PCR扩增，95℃预变性7 min;95℃变性30 s,66℃退火30 s,72℃延伸26 s,30个循环；72℃再延伸7 min。同时选用内侧引物进行常规PCR扩增，扩增体系同巢式PCR，扩增程序除循环数为38，其余程序同巢式PCR的第二步PCR检测。在此条件下对多堆柄锈菌、高粱柄锈菌（Puccinia sorghi）、青杨叶锈病菌（Melampsora laricipopulina）和7种玉米常见病原菌进行特异性检测，对不同梯度多堆柄锈菌基因组DNA和3种人工接种病叶进行灵敏度检测。【结果】巢式PCR检测体系仅在检测多堆柄锈菌时，产生了255 bp的目的条带，其他菌株均未扩增出目的条带。巢式PCR检测体系对多堆柄锈基因组DNA的最低检测限为10 fg·μL~(-1)，是常规PCR检测体系灵敏度的500倍。当1 g人工接种病叶含500—2.5×10~4个多堆柄锈菌夏孢子时，常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别0和85.71%，巢式PCR可检测出的夏孢子个数最少为1 000个；当1 g人工接种病叶中含1—7个夏孢子堆时，常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别76.19%和100%，常规PCR可检测出的夏孢子堆个数最少为2个，巢式PCR可检测出1个及以上夏孢子堆；当1 g人工接种病叶中含1—7个侵染点时，常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别14.29%和66.67%，检测出的侵染点个数最少分别为6个和3个。【结论】成功建立了一种以NX471-F/ITS4为外侧引物，NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR检测方法，可快速、高效、准确检测玉米叶片中潜伏期的多堆柄锈菌。

针对玉米种子机械裂纹检测准确率低的问题，提出一种基于双通道脉冲耦合神经网络(PCNN)模型的数字图像融合方法：1)运用离散小波变换(DWT)、非下采样轮廓波变换(NSCT)分别对预处理后的玉米种子机械裂纹图像进行分解，得到各自的高低频子带；2)对高低频子带系数分别采用不同链接强度的改进空间频率激励的双通道PCNN模型进行融合操作，得到融合后的高低频子带系数；3)通过NSCT反变换得到最终的玉米种子机械裂纹图像。试验结果表明：采用双通道PCNN模型检测玉米种子机械裂纹的准确率为97.2%；图像熵、相关熵、相关系数、均方根误差分别为0.351 1、1.731 4、0.983 5和0.526 3，整体优于LoG、DWT、NSCT和PCNN方法；双通道PCNN方法的单张图像的执行时间为14.900 7 s，运行时间最长，但效果最优。

为解决传统的种子活力检测方法存在耗时长、损伤种子等问题，实现种子活力的快速无损检测，分别利用机器学习和深度学习算法结合高光谱成像技术构建玉米种子3个活力梯度分类模型，通过人工老化方式将1 012粒玉米种子分为3个活力梯度样本，采集其高光谱数据后通过卷积平滑（SG）和多元散射校正（MSC）去除高光谱噪声，分别采用主成分分析（PCA）、连续投影算法（SPA）进行光谱特征降维，再从降维后的波段中抽取1 156、1 191和1 463 nm 3个波段合成假彩色图像，用局部二值模式（LBP）提取感兴趣区域的纹理特征，并与纯光谱特征融合。分别基于纯光谱特征构建决策树（DT）和支持向量机（SVM）模型和融合特征建立随机森林（RF）、SVM和极端梯度提升树（XGBoost）模型等机器学习模型。将假彩色图像输入ResNet18、MobileNetV2、DenseNet121、Efficientb0、Efficientb2等5个深度学习模型中进行玉米种子活力预测。结果显示，就机器学习方法而言，针对纯光谱特征表现最好的是PCA-SVM模型，其测试集准确率为92.5%；针对融合特征表现最好的是SVM模型，其测试集的分类准确率为93.1%；就深度学习方法而言，轻量化的MobileNet取得最高的测试集分类准确率99.5%；基于可解释的梯度定位类别激活映射方法表明，分类网络会重点关注玉米种子的中部或基部区域。

针对玉米种子机械裂纹检测准确率低的问题，提出一种基于双通道脉冲耦合神经网络(PCNN)模型的数字图像融合方法：1)运用离散小波变换(DWT)、非下采样轮廓波变换(NSCT)分别对预处理后的玉米种子机械裂纹图像进行分解，得到各自的高低频子带；2)对高低频子带系数分别采用不同链接强度的改进空间频率激励的双通道PCNN模型进行融合操作，得到融合后的高低频子带系数；3)通过NSCT反变换得到最终的玉米种子机械裂纹图像。试验结果表明：采用双通道PCNN模型检测玉米种子机械裂纹的准确率为97.2%；图像熵、相关熵、相关系数、均方根误差分别为0.351 1、1.731 4、0.983 5和0.526 3，整体优于LoG、DWT、NSCT和PCNN方法；双通道PCNN方法的单张图像的执行时间为14.900 7 s，运行时间最长，但效果最优。

利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定。通过序列比较,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物,并对所有参试菌株进行扩增。结果显示:该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299bp的条带,而其他参试菌株没有扩增信号。与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用,建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术,其检测灵敏度可达到4个细菌细胞,可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌。

目的明确甜玉米种子携带真菌种类,探讨真菌与种子活力的相关性。方法采用洗涤检测法和PDA平板法对市售7个甜玉米品种和2个普通玉米品种进行种子携带真菌检测,同时以滤纸卷法对种子活力进行测定。结果供试种子外部带菌量差异显著,主要菌群为镰刀菌属(Fusariumspp.)、青霉属(Penicilliumspp.)、曲霉属(Aspergillusspp.)和枝孢属(Cladosporiumsp.);种子内部带菌率在品种间差异显著,以甜玉米442最高,达到99.3%,普通玉米农大108最低,仅为4.4%;甜玉米种子内部寄藏优势菌群为镰刀菌属、青霉属、曲霉属、链格孢属(Alternariaspp.)、平脐蠕...

采用DAS-ELISA对从泰国进口的6个玉米品种的种子进行玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)检测,结果显示其中1个样品为MCMV阳性,其他品种为阴性。RT-PCR检测结果进一步证实该样品为阳性。对PCR产物进行测序,将分离物序列与已发布的23条MCMV序列进行比对和系统进化分析,结果表明该分离物的序列与中国分离物和泰国分离物的遗传距离较近,同分化在进化树的同一个簇。取5号样品的100粒种子进行DAS-ELISA检测,结果仅有2粒种子为阳性,即MCMV的检出率为2%。

为研究禾谷镰刀菌侵染后玉米幼根内转录组的变化情况，利用ＲＮＡｓｅｑ对禾谷镰刀菌接种后６和１８ｈ的感病玉米自交系Ｙ３３１分别进行转录组测序，分析接种后玉米幼根内差异表达的基因。结果表明：接种禾谷镰刀菌后，玉米幼根内共有５ １５３个基因差异表达；在接种后上调表达的聚类中，多种抗病过程相关的基因显著富集，包括苯丙烷类次生代谢物质合成过程的基因以及植物激素水杨酸（ｓＡｌｉｃＹｌｉｃ Ａｃｉｄ，ｓＡ）、茉莉酸（ＪＡｓｍｏＮｉｃ Ａｃｉｄ，ＪＡ）和乙烯（ｅｔｈＹｌｅＮｅ，ｅｔ）合成、响应及信号介导途径的基因；在下调表达的聚类中，植物生长发育、基础物质和能量代谢相关过程的基因显著富集。进一步分析发现：ｅｔ相．．．

应用玉米盐溶蛋白PAGE电泳方法检测了10个玉米品种的纯度及其杂交种的真实性。通过品种间的盐溶蛋白谱带的对比,发现其中有2条蛋白带是各品种所共有的,而除这些共有的蛋白带以外,各品种还具有一些特异条带。根据每个品种特有的蛋白条带,建立其特征条带图谱,可应用于该品种的相关鉴定工作。

为探索快速、高效检测甜玉米种子生活力的方法,利用机器视觉技术(Seed Identification)批量快速提取金菲甜玉米种子的Red(红基色)、Green(绿基色)、Blue(蓝基色)、Hues(色相)、Saturation(饱和度)、Brightness(亮度)、Light(明度)、a(红色至绿色的范围)、b(蓝色至黄色的范围)、灰度、宽度、长度和投影面积等物理特征参数,通过单粒发芽试验确定每粒种子的生活力,然后采用人工神经网络和二元逻辑回归结合主成分分析进行建模。结果表明:1)a值、b值、Saturation和投影面积与种子的活力均存在极显著或显著相关,且变异系数相对较大,其中当a≤3时,发芽率可从72.7%提升至77.6%,获选率达到79.4%;投影面积≤77.31mm2时,发芽率可提升至73.7%,获选率87.6%;2)用13个物理指标标准化后直接进行人工神经网络建模,双隐藏层(训练集∶测试集=6∶4)建模,模型整体预测正确率为74.2%,优质种子获选率达到93.8%,发芽率可提升至76.9%;3)经二元逻辑回归模型预测发芽率为74.5%,但神经网络模型稳定性优于二元逻辑回归建模。

本试验针对已商品化的转基因大豆、玉米和水稻的主要外源基因Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因和PAT基因及共有的内标准基因RBCL基因设计了10对引物,对从超市购买的进口大豆、玉米和水稻的11种深加工制品(未标注是否含有转基因成分)进行了五重巢式PCR定性检测。第1轮普通五重PCR检测,11个待测样品均未出现任何转基因成分,其灵敏度为0.5%;第2轮将普通五重PCR扩增产物进行五重巢式PCR检测,结果在卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品和婴儿米粉中扩增出RBCL基因,玉米淀粉和玉米泥中扩增出RBCL基因、Cry1A(B)基因和PAT基因;玉米蛋白粉扩增出RBCL基因、Cry1...

以单粒玉米杂交种子发芽4￣5d的幼苗为试材,提取葡萄糖苷酶进行电泳检测,根据亲本玉米葡萄糖苷酶1(Glul)等位基因的突变类型,准确、快捷地检测玉米杂交种子纯度。

经几年来对240个玉米品种(系),62841株的调查,从中发现54个品种(系)出现种子带毒苗,平均带毒苗率为0.56%,最高的6174×墨黄二为27.03%。后经过对25个品种(系)进行田间种子带毒苗率的测定,有16个品种(系)出现种子带毒苗,带毒苗率为1.23%～6.90%。经过种子存放时间、种衣剂包衣和不同温度处理种子带毒测定结果表明,玉米种子存放31个月后,所携带的矮花叶病毒仍具有侵染活性,种衣剂包衣和不同温度处理也不能使病毒失去活性。通过不同种植方式带毒测定结果证明,地膜覆盖种植可大幅度降低种子带毒苗率。因此,地膜覆盖种植对降低初侵染源具有明显的作用。

为了更快更准确地在病菌潜伏期或发病初期鉴定出尖孢镰刀菌引起的瓜类枯萎病和茄病镰刀菌引起的瓜类根腐病这2种病害,根据尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的翻译延长因子TEF1-α序列设计了3条种特异性引物。引物对FO-F和Fu-R可以从尖孢镰刀菌中扩增到1条228 bp的片段,引物对FS-F和Fu-R可以从茄病镰刀菌中扩增到1条347 bp片段,并且3条引物FO-F、FS-F和Fu-R可以同时在1个PCR反应中扩增到2个片段,而这2对引物都不能从其他病原真菌中扩增到任何条带。结果表明,该多重PCR检测方法可以同时鉴定样品中的2种镰刀菌。