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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李越 池慧兵 牛家峰 马斌 周慧敏 朱萍 吕凤霞
[目的]呕吐毒素（deoxynivalenol，DON）C3位羟基的异构化是生物脱毒的关键部位，其中DepA作为DON生物转化中第一步关键限速酶，存在催化活性低的问题，限制了其在食品及饲料加工领域中的应用。本文旨在通过定向进化技术对DepA进行分子改造，以期获得催化活性显著提高的突变酶，提高其工业化应用的潜力。[方法]通过易错PCR和DNA shuffling相结合的方法，构建突变文库，经高通量筛选后，对催化活性明显提高的突变体进行酶学性质表征。同时，采用分子动力学模拟和三维结构模拟分析，探究突变酶催化活性提高的分子机制。[结果]成功筛选到突变酶S2、S10和S12，与野生型相比，比活力分别提高了207%、293%和268%。动力学参数结果显示，突变酶S2、S10和S12的K_(m)值分别为56.89、27.00和40.65 μmol·L~(-1)，是野生型的91.7%、43.5%和65.5%，k_(cat)/K_(m)值分别为327.30、576.67和380.07 L·mmol~(-1)·s~(-1)，是野生型的1.25、2.20和1.45倍，相比野生型，突变酶亲和力和催化效率均显著提高。此外，采用分子动力学模拟和三维结构模拟分析，发现柔性增加、底物DON的进攻距离缩短、氢键增加、疏水性增加和远端效应是导致其催化活性提高的主要原因。[结论]本研究通过易错PCR和DNA shuffling相结合的定向进化策略有效提高了呕吐毒素解毒酶DepA的催化活性，为其工业化应用提供依据。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周慧敏 牛家峰 池慧兵 马斌 朱萍 陆兆新 吕凤霞
[目的]呕吐毒素（DON）广泛存在于粮谷类原料及其制品中，对人和动物的健康都造成严重危害。然而，现有呕吐毒素解毒酶存在种类少、催化性能差等问题，限制了其在食品加工和饲料中的应用。本研究采用理性设计策略对呕吐毒素解毒酶DepB进行分子改造，以提高DepB的催化活性。[方法]通过对底物10 ?范围内的氨基酸残基进行丙氨酸和甘氨酸扫描，确定突变“热点”氨基酸残基。随后，采用定点饱和突变和组合突变技术筛选得到催化活性显著提高的突变酶，并对其进行三维结构模拟和分子动力学模拟，分析其催化活性提高的分子机制。[结果]获得了催化活性显著提高的三点突变酶A289V/A227R/S54N，该酶比活力为335.77 U·mg~(-1)，是野生型DepB的2.25倍。动力学参数显示，三点突变酶的K_(m)值由95.11 μmol·L~(-1)下降到58.33 μmol·L~(-1)，k_(cat)/K_(m)比值由5.99 mmol~(-1)·L·s~(-1)提高至16.94 mmol~(-1)·L·s~(-1)，亲和力和催化效率均显著提高。通过三维结构模拟和分子动力学模拟分析，发现空间位阻减小、静电相互作用增强、酶-底物-辅酶结合自由能降低是其催化活性提高的分子机制。[结论]基于理性设计策略提高了DepB的催化活性，强化了DepB的适用性能，为呕吐毒素解毒酶的分子改造及其在食品加工和饲料中的应用提供依据。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李若楠 康瑞芬 沈丹 戴鹏远 唐倩 李春梅
[目的]本试验以猪空肠上皮细胞（IPEC-J2）为模型，探讨谷氨酰胺（Gln）对呕吐毒素（DON）诱导的IPEC-J2细胞凋亡和炎症的影响。[方法]通过MTT方法测定细胞活力来选择适宜的Gln浓度，以不添加Gln和DON的细胞为空白对照组，试验组分别为0.75 mmol·L~(-1) Gln组，2.0 μg·mL~(-1) DON组和2.0 μg·mL~(-1) DON+0.75 mmol·L~(-1) Gln组，处理24 h后测定各组细胞凋亡率、活性氧自由基（ROS）及细胞凋亡和炎症相关基因和蛋白的表达水平。[结果]与对照组相比，DON处理24 h显著升高细胞的凋亡比例和ROS含量(ROS荧光密度/细胞总数)（P<0.01）；与DON组相比，DON+Gln组显著降低细胞的凋亡比例和ROS含量（P<0.01）。与对照组相比，DON组上调了IPEC-J2细胞白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL–6）、环氧合酶2（COX–2）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）炎症相关基因和Caspase-3及Caspase-8凋亡相关基因的表达水平；与DON组相比，DON+Gln组下调了IPEC-J2细胞IL-1β、COX–2、Caspase-3、Caspase-8、BAK和Bcl-2基因的表达水平。蛋白免疫荧光结果显示，与对照组相比，DON组上调IPEC-J2细胞Caspase-3，核转录因子κB（NF-κB）和磷酸化核转录因子κB（phospho-NF-κB）蛋白的表达，而添加Gln后（DON+Gln组）下调了相关蛋白的表达。[结论]Gln通过清除DON诱导的IPEC-J2细胞中过量的ROS和调节炎症和凋亡相关基因及蛋白的表达量来缓解由DON引起的肠道上皮细胞损伤。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
黄伟 何慧禹 鲁鹏 陈翊平
为实现谷物中呕吐毒素（deoxynivalenol,DON）的快速、灵敏检测，采用生物传感和化学发光技术相结合的方式，研制应用于现场快速检测谷物中呕吐毒素的化学发光光纤免疫传感器，并搭建用于化学发光信号检测的便携式传感平台。整个检测平台集成到一个32 cm×15 cm×25 cm的黑色避光盒中，质量小于3 kg。结果显示：所研制的化学发光光纤免疫传感器在0.1～1 200 ng/mL呈现出良好的线性关系，检出限为62.7 pg/mL；功能化的光纤探针能够稳定保存30 d且具有良好的特异性和抗干扰性；其应用于谷物样品的呕吐毒素检测回收率为81.00%～107.33%，相对标准偏差小于8.69%。结果表明，该方法较ELISA法的灵敏度提高了30倍，线性范围拓宽了3个数量级，适合应用于谷物样品中呕吐毒素的现场快速检测。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李荣佳 李治忠 周闯 司慧民 吴文达 张海彬
[目的]评价一种新型吸附剂HG对黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)和呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)的吸附效果。[方法]以水合硅酸铝钠钙(HSCAS)为基础,配合葡甘露聚糖(GM),以合理配比制备成一种新型复合吸附剂HG,通过体外等温吸附试验、不同p H值下的吸附试验以及蛋雏鸡体内试验等,综合评价其吸附效果。[结果]HG对AFB1的吸附符合Langmuir方程,平均吸附率为90.24%;HG对DON的等温吸附则无规律,平均吸附率为28.08%。HG能够改善由霉变饲料引起的肝脏、肾脏、脾脏的肿胀,以及胸腺和法氏囊的萎缩,可将总蛋白、白蛋白含量和血清酶活性恢复至正...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
荆雅玮 左佳坤 王志豪 胡剑刚 黄燕 米荣升 苗晋锋 温纳相 陈兆国 韩先干
#N/A
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王钦 李建林 唐永凯 李红霞 张磊 沈泽恩 俞菊华
[目的]本文旨在获得可溶的鲤鱼(Cyprinus carpio)groupⅢ分泌型磷脂酶A_2(PLA2g3a1)催化活性区(PLA_2 bee venom like region,PBVR)原核重组蛋白,并测定该蛋白的磷脂酶活性。[方法]分别构建标签蛋白小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)、硫氧还原蛋白(thioredoxin A,TrxA)、N利用物质A(N-utilization substance A,NusA)、麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)与PBVR的重组表达质粒,转化入大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)进行原核表达,比较不同标签蛋白的促溶作用;使用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,与BSA蛋白标准品电泳比对确定纯化后蛋白的浓度;采用偶联氧脂合酶法测定PBVR重组蛋白的磷脂酶活性。[结果]促溶作用最高的标签蛋白是NusA,可溶性重组蛋白占总蛋白的95%,其次是MBP和TrxA,分别占87%和47%。综合考量可溶性重组蛋白的得率,选择MBP融合蛋白。重组原核表达蛋白MBP-PBVR的磷脂酶比活力[(13.68±0.12)U·μmol~(-1)]显著高于TrxA-PBVR[(0.94±0.01)U·μmol~(-1)]和NusA-PBVR[(0.93±0.04)U·μmol~(-1)](P
[期刊] 林业科学
[作者]
鄢杰明 钟华 严俊鑫 严善春
为了研究多杀菌素对森林害虫舞毒蛾的杀虫活性,采用叶片药膜法测定多杀菌素对舞毒蛾3龄和5龄幼虫的生物活性及致死中量对其体内解毒酶活性的影响。结果表明:多杀菌素24h致死中浓度(LC50)分别为0.0249mg·L-1(3龄)和0.2269mg·L-1(5龄);致死中量多杀菌素对舞毒蛾3龄和5龄幼虫体内解毒酶存在不同程度的影响,其中对羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多功能氧化酶(MFO)和碱性磷酸酯酶(ALP)大体上均表现为先激活后抑制作用,差异显著(P<0.05);而对酸性磷酸酯酶表现为抑制-激活-抑制作用,差异极显著(P<0.01)。LC10和LC50剂量的多杀菌素对舞毒蛾...
关键词：
多杀菌素 舞毒蛾 解毒酶
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
徐达 吴小卡 荆雅玮 左佳坤 米荣升 黄燕 陈兆国 王成明 韩先干
[目的]细菌的sah H基因编码S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(Sah H),该酶参与细菌的甲硫氨酸循环(AMC),调控细菌的多种生理功能。[方法]通过构建重组表达质粒p ET28a-Bru-sah H和p ET28a-Pse-sah H,分别表达布鲁菌(Brucella abortus)S2308株和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1株的Sah H重组蛋白Bru-Sah H和Pse-Sah H。将纯化后的Bru-Sah H、Pse-Sah H以及我们前期表达纯化的禽致病性大
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张超 王丕武 张卓
【目的】克隆大豆查尔酮还原酶3基因(chr3),并分析其编码蛋白体外催化活性,为研究大豆苷元的合成与调控研究提供参考。【方法】以大豆品种"吉农17"为材料,采用RACE技术扩增大豆chr3基因,对其编码蛋白的结构和功能位点进行分析。将目的基因chr3连接到大肠杆菌载体pET28a上,然后转化到大肠杆菌BL21中,构建重组大肠杆菌原核表达载体BL21-pET28a-chr3,并通过高效液相色谱技术(HPLC)验证重组蛋白的催化性质及效率。【结果】成功克隆chr3基因,其全长序列长1 416bp(GenBank登录号:KF927169),成功构建了大肠杆菌原核表达载体BL21-pET28a-chr...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘祥英 李琼轩 柏连阳
以高压汞灯为光源,研究纳米二氧化钛(TiO2)降解毒死蜱的反应动力学,考察纳米TiO2用量、毒死蜱起始质量浓度及溶液pH值对毒死蜱光催化降解速率的影响。结果表明,纳米TiO2最佳用量为50～100 mg/L,毒死蜱初始质量浓度在5～80 mg/L时,其降解反应符合一级反应动力学规律,表现为毒死蜱质量浓度越大,降解速率常数越小,半衰期越长,毒死蜱质量浓度为80 mg/L的半衰期为27.18 min,比质量浓度5 mg/L时的长1.5倍;碱性条件有利于毒死蜱的降解。
关键词：
毒死蜱 光催化 纳米二氧化钛 动力学
[期刊] 林业科学研究
[作者]
李慧 严善春 王志英 葛士林 曹传旺
采用质量法和酶活性测定法研究了毒死蜱对舞毒蛾(Lymantria dispar)3龄幼虫食物利用的影响,并测定了其毒力及解毒酶、乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性。用亚致死浓度(1.5 mg.L-1)毒死蜱处理小黑杨叶片,饲喂舞毒蛾3龄幼虫,其幼虫生长率(RGR)、食物利用率(ECI)和食物转化率(ECD)均显著低于对照,而近似消化率(AD)显著高于对照,相对取食量(RCR)处理和对照间差异不显著。毒死蜱对舞毒蛾幼虫24 h致死中浓度(LC50)为5.86 mg.L-1,其毒力低于三氟氯氰菊酯而高于氧化乐果。毒死蜱对舞毒蛾3龄幼虫体内羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和AChE均...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
武淑文 蒲鑫 吴益东
害虫解毒代谢增强是对杀虫剂产生抗性的重要机制。为此,本研究建立了Bt棉田重要害虫绿盲蝽和中黑盲蝽成虫多功能氧化酶、酯酶和谷胱甘肽S转移酶3种解毒酶活性的测定方法。研究结果表明:以DCNB(1,2二氯4硝基苯)为底物,不能检测到棉盲蝽谷胱甘肽S转移酶的活性;棉盲蝽多功能氧化酶活性也不宜选用动力学法进行测定。同时2种棉盲蝽成虫的日龄对解毒酶活性影响不明显。因此,对由不同日龄成虫组成的棉盲蝽田间种群可以直接进行解毒酶活性的检测。
[期刊] 林业科学
[作者]
田雨浓 马伟 韦庆慧 韩旭洋 罗帅 陈旭日 邱本军 马玲
当今人们的环保意识不断提高,寻找替代化学农药进行有害生物综合防治成为当今各国科研工作者关注的热门话题(Isman,2008;Rajendran et al.,2008)。随着精油类农药商品化的成功,这必将大力促进此类植物源农药的研制,可以预见植物精油用于植物病虫害的防治将是今后的发展趋势之一(袁海滨等,2007)。
关键词：
α-蒎烯 大麦虫 急性毒性 解毒酶
[期刊] 林业科学
[作者]
郭同斌 嵇保中 诸葛强 黄敏仁
用转Bt单基因和转Bt+CpTI双价基因杨树叶片饲喂杨小舟蛾,幼虫中肠酯酶的活力在饲喂初期显著升高,但在饲喂一定时间后受到抑制:转Bt单基因杨树在饲喂24h开始受到抑制,48h受到明显抑制,较对照下降了15.8%;而转双价基因杨树在饲喂12h受到明显抑制,较对照下降了38.1%。转双价基因杨树对中肠酯酶的抑制作用大于转Bt单基因杨树。转Bt单基因杨树对幼虫中肠羧酸酯酶的抑制能力不强,而转双价基因杨树对中肠羧酸酯酶的抑制作用大于转Bt单基因杨树,饲喂12h后活力开始受到抑制,饲喂24、36、48h的活力分别较对照下降了33.4%、22.5%、29.6%,与对照均有显著差异。转基因杨树主要通过抑制...
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