【目的】亚油酸是一种人体必需的脂肪酸,能加快体内脂肪代谢与分解、减少胆固醇在血管壁上形成积存、有效预防动脉硬化的发生、提高人体免疫力、促进骨骼发育、提高记忆力、预防脑部功能退化等功能。利用基因编辑技术对控制脂肪酸合成途径的关键酶ω-3脂肪酸去饱和酶基因进行精准编辑,关闭下游产物的合成途径,以便提高水稻上游亚油酸的含量,为创制富集亚油酸水稻材料提供依据。【方法】水稻脂肪酸合成途径中的关键酶ω-3脂肪酸去饱和酶基因(OsFAD3)存在2个拷贝,分别分布在第11和第12染色体,且两者cDNA同源性达97.32%。根据基因编辑原理(编辑的特异性取决于引导RNA(gRNA)的特性),在2个同源基因序列高度一致的外显子区域,分别设计合成2个gRNA,并分别构建植物基因编辑载体,利用农杆菌介导法转化本地受体材料(富源4号)。通过对基因编辑植株进行靶位点测序鉴定,分析2个位点的编辑效率和基因型。同时,对OsFAD3双突变体进行粒宽、粒长等主要籽粒农艺性状分析。采用气质联用检测法测量OsFAD3双突变体籽粒的37种脂肪酸含量。【结果】获得2个位点的纯合编辑材料,同时也获得了其他不同基因型组合的编辑材料;与对照材料相比,OsFAD3双突变体的粒宽、粒长等主要籽粒农艺性状均没有发生显著变化,但稻谷中亚油酸的相对含量提高了3.36个百分点。【结论】在不改变籽粒主要农艺性状的前提下,实现了利用基因编辑技术通过转化一个载体同时精准敲除2个ω-3脂肪酸去饱和酶基因,提高了籽粒中亚油酸的相对含量。

【目的】种质资源是作物育种的基础,创制具有多种表型特征的高油酸花生新材料,对高油酸花生育种具有重要意义。【方法】以常规品种白沙1016和高油酸花生品系CTWE为材料,通过对2个亲本ahFAD2A和ahFAD2B ORF的扩增与序列分析,确定其突变类型;利用等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)对两亲本油酸性状基因型进行确认;采用单粒近红外光谱技术(near infrared reflectance spectroscopy,NIRS)结合气相色谱(gas chromatographic,GC)分析对各世代单株的油酸及亚油酸含量进行测定;利用产量性状及油酸含...

【目的】创造块茎高支链淀粉或纯支链淀粉含量的转基因马铃薯材料。【方法】以构建的由Patatin启动子驱动的pBI121g-PgABI为干扰表达载体,采用农杆菌介导法转化马铃薯优良品种甘农薯2号。用PCR、Southern blotting、半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术检测转基因植株,并对转基因植株的微型薯进行淀粉含量的测定。【结果】通过农杆菌介导法获得10个转基因株系。PCR和Southern杂交结果证明,目的基因已被整合到基因组中,通过半定量RT-PCR分析表明,转基因株系中GBSSI的表达均受到明显抑制,且在6个转基因株系中检测不到mRNA的表达。进一步通过real-time...

【目的】创制Ogura细胞质不育(Ogura CMS)的恢复系是利用Ogura CMS种质资源的有效途径。本研究基于已获得的BC2代育性恢复单株15Q23,继续用芥蓝进行回交,通过分析育性恢复基因Rfo的传递效率,及BC3代Rfo阳性株的遗传背景、育性表现、结实性和倍性,从而加速甘蓝类蔬菜Ogura CMS恢复材料的创制,获得甘蓝类蔬菜Ogura CMS恢复系。【方法】以BC2代育性较好的单株15Q23为父本,Ogura CMS芥蓝15Y102为母本进一步回交,利用Rfo特异分子标记对所有回交后代进行筛选,计算BC3代Rfo传递效率,并调查BC3代Rfo阳性单株的形态特征、育性恢复情况、结实性、倍性;选取遗传背景近于芥蓝、结实较好的重点单株继续回交获得BC4代,分析BC4代Rfo传递效率和阳性单株倍性。【结果】在开花的不同时期,单株15Q23花粉活力差异明显,以不同时期的花粉进行回交的结实性也存在极显著差异(P50%)进行回交,以单株16Q1-4和单株16Q1-10当父本时结实性最好,结实率分别为15%和9%,显著高于BC2代阳性单株15Q23(7%,P

[目的]创制可以稳定遗传的黄籽甘蓝型油菜种质,为黄籽油菜材料的创制与利用奠定理论与实践基础。[方法]以甘蓝型油菜BnaTT2基因为研究对象,以甘蓝型油菜K407为受体材料,构建相应单靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导法将载体转化入油菜植株,测定获得的黄籽油菜基因编辑材料TT2-Mutant的籽粒色度和千粒质量,并用红外分析仪测定其脂肪酸组分相对含量和含油量。[结果]对甘蓝型油菜T_1代转基因株系靶位点的序列检测和突变类型分析结果表明,BnaTT2基因靶位点被成功编辑,编辑类型为单碱基的插入或缺失。获得的T_2代BnaTT2基因缺失油菜材料籽粒千粒质量(4.74 g)相比对照材料K407(3.62 g)增大;种子颜色变黄,黄色度等级为4.8;籽粒中的含油量极显著升高6.10%,亚油酸和亚麻酸相对含量分别极显著提升3.13%和4.99%,芥酸相对含量则极显著降低1.53%。[结论]BnaTT2基因敲除后可导致相应功能缺失,从而改变油菜籽的种皮颜色,并对其脂肪酸组成产生影响。

【目的】黄瓜(Cucumis sativus L.)遗传基础狭窄,种质资源多样性较为有限,遗传育种研究相对落后。本试验旨在创制整倍体和非整倍体黄瓜种质材料,建立其准确的染色体组成鉴定方法,为进一步选育黄瓜各种染色体系、目标性状的染色体定位及遗传育种研究奠定基础。【方法】以华北生态型黄瓜‘长春密刺’的高代自交系为材料,0.4%秋水仙素溶液处理萌动种子,诱导染色体数目加倍。为获得同源三倍体材料,以诱导获得的同源四倍体为母本,二倍体为父本进行杂交,授粉35—45 d后采收成熟果实进行胚拯救。采用染色体计数,结合形态学、叶片气孔电镜观察,对诱导株及杂交后代的倍性进行鉴定。利用染色体特异的探针进行荧光原...

[目的] 本文旨在创制优质的菜薹四倍体新材料。[方法] 采用2 g·L~(-1)的秋水仙素溶液点滴二倍体LCX019幼苗的子叶生长点，通过形态学、解剖学、细胞学与流式细胞仪的方式筛选鉴定出同源四倍体植株，并对二、四倍体植株的农艺性状以及品质特性进行分析比较。[结果] 形态学与解剖学结果显示，同源四倍体菜薹在株型、叶片、花、种荚、菜薹等方面表现出“巨大性”的特点；气孔孔径变大，气孔密度下降；花粉粒体积相比二倍体增大，形状呈橄榄球形或不规则形状。细胞学结果显示，四倍体菜薹根尖染色体数目为二倍体的2倍；流式细胞仪的结果分析表明，四倍体的DNA荧光强度约为二倍体的2倍。营养品质方面，四倍体菜薹的可溶性糖含量、有机酸含量及纤维素含量显著上升76.17%、13.71%以及80.34%，叶绿素含量、硝态氮含量显著下降25.01%、45.10%，可溶性蛋白含量无显著变化。通过分析二、四倍体的光响应曲线与光合特性，发现四倍体菜薹LCX019对弱光的利用能力强于二倍体植株。[结论]获得了具有优良品质的菜薹同源四倍体新材料，为菜薹的育种工作提供新的种质资源。

水稻化感材料PI312777和化感1号在田间能显著地抑制杂草,而且其抑草作用与栽培方式相关,抛秧和移栽方式对杂草的抑制作用明显地优于直播。结果表明,PI312777和化感1号植株产生和释放的化感物质(多酚、黄酮和羟基肟酸)显著高于非化感品种华粳籼1号,而且在6叶期植株中的化感物质含量达最大值。这种不同水稻材料植株在不同生育期产生并释放化感物质量的差异是导致它们在田间抑草效应强弱的重要原因之一。进一步研究发现,PI312777植株由地上部分合成化感物质后经根部分泌到环境中,根组织并不产生化感物质,且稗草能诱导PI312777植株产生和释放更大量的化感物质。在水培条件下,PI312777根分泌的化...

为了挖掘水稻苗期耐冷基因,基于比较转录组分析,参考公共数据库中的基因序列信息设计靶位点,对冷胁迫条件下东乡野生稻苗期下调表达耐冷相关基因BGIOSGA032296进行TALEN基因组编辑技术构建,克隆酶切鉴定和序列比对结果表明,BGIOSGA032296 TALEN敲除植物表达载体1301TALEN-032296构建成功,利用农杆菌介导法将TALEN敲除植物表达载体1301TALEN-032296转入水稻受体品种TP309,获得了17株转基因水稻植株,经潮霉素抗性标记基因和Fok I基因特异引物PCR检测

针对水稻黑条矮缩病毒（ＲＢＳＤＶ）的核心粒子外壳蛋白基因（Ｓ８）、毒质与非结构蛋白基因（Ｓ９）及其嵌合基因（Ｓ８＆Ｓ９）构建了６个ＲＮＡｉ载体，经农杆菌介导转化武陵粳１号获得转基因植株。通过潮霉素溶液浸泡法对转基因植株进行初步筛选，剔除假阳性植株；再通过ＰＣＲ从ＤＮＡ水平进行转基因阳性鉴定；进一步通过ｑ ＲＴ–ＰＣＲ从ＲＮＡ水平进行转基因表达量分析。选取ｑ ＲＴ–ＰＣＲ表达量高的单拷贝纯系Ｓ８后代进行灰飞虱传毒试验，结果表明，含有Ｓ８ ＲＮＡｉ片段的转基因水稻材料对ＲＢＳＤＶ具有一定抗性。

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T_0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T_1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T_2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295μg·g~(-1),极显著(P<0.01)高于非转基因对照(0.046μg·g~(-1))。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。

【目的】易落粒既不利于稻谷收获,也不适宜于水稻机械化生产。利用现阶段前沿的分子育种手段——CRISPR/Cas9技术对水稻落粒性主效基因qSH1进行定点编辑,并调查分析易落粒性状的改良效果,为创制稳产和适合机械化生产的水稻新种质奠定材料基础和探索新途径。【方法】以qSH1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶标位点。将所设计的靶点序列在水稻参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出qSH1-T1和qSH1-T5靶标位点。化学合成靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pYLg RNA-U3、pYLg RNA-U6a载体连接构建U3-qSH1T5-g RNA、U6a-qSH1T1-g RNA表达盒,最后将2个g RNA表达盒同时连接至pYLCRISPR/Cas9表达载体中,构建pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表达载体。利用农杆菌介导转化易落粒的籼稻品种HR1128,以潮霉素抗性为筛选标记筛选获得T0代转基因阳性植株。利用靶位点扩增测序法判断T0代转基因植株在预期靶标位点是否发生突变,并进一步分析突变类型及基因型。将靶点序列在水稻参考基因组中比对,选择与靶点序列匹配度大于或等于15 bp且3′端具有NGG的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估。利用潮霉素基因及靶点检测进一步筛选无T-DNA成分的qsh1突变植株并进一步构建qsh1突变系,并分析qsh1突变系的落粒性、qSH1的表达量及预测编码氨基酸序列。【结果】pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51载体成功地实现了对qSH1靶标位点的定点编辑。在T0代转基因阳性植株中获得7个突变单株,其中qSH1-T1和qSH1-T5靶点的突变频率分别为54.55%和63.64%,突变基因型包括纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变,突变类型包括碱基插入、碱基缺失及碱基突变。通过对T1代植株进行潮霉素基因筛选、靶位点扩增测序,结果表明,在T1代植株中Cas9载体骨架和qSH1突变位点都发生了分离,获得2种不含T-DNA成分的qsh1纯合突变株,并以此构建2个T2代qsh1纯合突变系群体(17SZ01和17SZ02)。对46株转基因阳性植株进行脱靶效应分析,发现3个潜在脱靶位点均未发生突变,表明所设计的靶标位点具有较高的特异性。通过落粒性测定分析表明,与野生型对照相比,2个qsh1纯合突变系的落粒性显著降低。进一步分析发现,2个突变系氨基酸翻译均发生改变并提前终止,同时17SZ01突变系qSH1的表达量显著降低。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻基因组进行定点编辑定向改良水稻品种落粒性,是一条高效、安全的分子改良育种策略。

【目的】探讨抗白叶枯病兼抗细条病基因在杂交稻抗性改良利用中的可行性，为丰富我国水稻育种遗传基础提供参考依据。【方法】利用分子标记方法对102份水稻品种资源（材料）进行抗白叶枯病兼抗细条病xa5基因筛选。以携带xa5基因且对白叶枯病和细条病具有良好兼抗性的亲本为抗源，与感病栽培稻杂交，通过系谱法，结合分子标记辅助选择，培育优良杂交稻恢复系。优良恢复系与不育系组配出强优势组合，分析强优势组合的抗性和综合农艺性状。【结果】从102份水稻品种资源（材料）中筛选出兼抗白叶枯病和细条病xa5基因的稻种资源17份，经抗性鉴定，DP3、IRBB5、N36、N776、N777、N779和P89对白叶枯病和细条病均表现较好的兼抗性。以广恢998为母本、以DP3与9311的杂交后代优良单株Y240-1为父本进行杂交，结合分子标记辅助选择，经多代自交选育，培育出含xa5基因的优良恢复系野香占。以野香占为父本、不育系平丰A为母本组配出强优势杂交组合平丰优香占。该组合对白叶枯病和细条病均表现为中抗，同时中抗稻瘟病，米质达到部标2级优质米标准。【结论】抗水稻白叶枯病兼抗细条病的xa5基因具有部分显性效应，可用于杂交水稻育种改良；培育出含有野生稻血缘的野香占能组配出中抗白叶枯病和细条病强优势水稻杂交组合，有助于丰富和拓宽水稻育种遗传基础。

【目的】对EMS诱变甘蓝型油菜后代主要脂肪酸含量进行检测,并对M2代中获得的高油酸材料在分子水平进行分析。【方法】利用0.5%、1.0%和1.5%共3个EMS浓度处理甘蓝型油菜(湘油15号),分析检测M1和M2代的主要脂肪酸含量;分别克隆高油酸突变体05-4和对照材料FAD2基因,对其进行核苷酸和氨基酸序列分析。【结果】浓度为1.5%时处理M2代发现了一株高油酸植株(油酸含量71%);序列分析表明,高油酸材料FAD2A基因第614位碱基A突变成G导致天冬氨酸变成甘氨酸,FAD2B基因第59位碱基A突变成C导致天冬酰胺变成苏氨酸,在第722位碱基A突变成T导致酪氨酸变成苯丙氨酸。【结论】采用浓度...

选用初始体重为（６０．９８±３．８２）ｇ的吉富罗非鱼（ＯｒｅＯｃｈｒＯｍｉｓ ｎｉｌＯｔｉｃｕｓ）６３０尾，随机分成７组（每组设３个重复，每个重复３０尾），饲喂亚油酸含量分别为０．０７％（对照组）、０．３６％、０．６１％、１．０３％、２．００％、３．００％和４．１５％的７种半纯化等能等氮饲料１０周。结果表明，鱼体增重率、饲料效率、蛋白质效率和蛋白质沉积率均在亚油酸水平为１．０３％时较对照组差异显著（Ｐ＜０．０５），且均在饲料亚油酸水平为２．００％时达到最大。经二次回归分析，饲料亚油酸水平为２．４９％和２．６６％时吉富罗非鱼分别获得最大增重率和最高饲料效率。通过折线回归发现饲料亚油酸水平为１．０．．．