【目的】研究地西泮结合抑制剂(diazepam binding inhibitor,DBI)在牦牛不同大小卵泡中的表达水平与定位,探讨DBI蛋白在牦牛卵泡发育过程中的调控作用。【方法】采集牦牛卵巢组织,分离不同大小(直径<3 mm,直径3～8 mm,直径>8 mm)的卵泡。采用实时荧光定量方法(q RT-PCR)检测DBI基因m RNA在牦牛不同大小卵泡中的相对表达量,并利用蛋白免疫印迹技术(Western-blotting,WB)检测DBI蛋白的表达情况。采用免疫组织化学方法(immunohisto chemistry,IHC)定位DBI蛋白在雌性牦牛完整成熟卵泡中的分布情况。采用免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)检测DBI在牦牛卵母细胞中的定位。【结果】DBI基因m RNA和DBI蛋白在牦牛不同大小卵泡中均表达,但表达水平存在显著差异(P<0.05),表达量随着牦牛卵泡直径的增大而显著上升。DBI蛋白在牦牛成熟卵泡中的颗粒细胞、卵丘细胞均有分布;在卵母细胞中主要定位于细胞质、细胞核。【结论】DBI在类固醇激素合成与卵母细胞成熟过程中具有重要作用。

【目的】分析牦牛卵泡发育过程中组蛋白赖氨酸脱甲基酶1(lysine-specific histone demethylase 1A,KDM1A)基因的表达谱,探讨KDM1A对牦牛卵泡发育和卵母细胞成熟的影响。【方法】以牦牛卵泡为研究对象,根据卵泡直径的大小,将卵泡分为3组:大(6.0—9.0 mm)、中(3.0—5.9 mm)、小(1.0—2.9 mm)卵泡,收集各组别卵泡中卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex, COCs)进行体外培养,对不同发育阶段卵泡中卵母细胞的体外成熟率进行统计并分析;分别提取各组卵泡卵母细胞及壁层颗粒细胞总RNA,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time RCR, RT-qPCR)方法,检测KDM1A基因在不同发育阶段的卵泡中mRNA相对表达量的变化;采用免疫组织化学技术检测KDM1A在牦牛卵泡发育过程中的细胞定位及表达规律,并结合体外成熟与RT-qPCR结果进行关联性分析。【结果】各组卵母细胞体外成熟率与卵泡直径的大小呈显著正相关关系,其伴随卵泡发育的进行呈明显的上升趋势,其中大、中、小卵泡组的体外成熟率依次分别为90.53%、88.10%、55.14%。RT-qPCR结果显示,KDM1A基因在牦牛卵泡发育过程中均有表达,且不同发育阶段的mRNA表达水平差异显著,其中大、中卵泡时期的卵母细胞中的mRNA相对表达量显著低于小卵泡时期(P 0.05)。免疫组织化学研究发现KDM1A在大、中、小卵泡壁层颗粒细胞以及膜细胞中均表达,其蛋白表达趋势与RT-qPCR结果吻合,即随着发育时间的进行KDM1A表达水平呈上升趋势,其中在大卵泡时期KDM1A的表达量最高。【结论】在牦牛不同发育时期卵泡的卵母细胞及壁层颗粒细胞中KDM1A mRNA及蛋白的表达水平呈动态变化,提示KDM1A在卵泡发育及卵母细胞成熟过程中发挥重要作用。这可能与卵母细胞的减数分裂及颗粒细胞的增殖分化有关,本研究为进一步研究该基因在牦牛卵母细胞减数分裂过程中的作用机制提供基础数据。

【目的】探讨牛卵泡颗粒细胞中可卡因－苯丙胺调节转录肽（ｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄ ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ，ｃａｒｔ）的表达对牛不同阶段卵泡发育的影响。【方法】通过对牛卵泡转录组ｏｄＦ１（ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ｏｎｓｅｔ ｏＦ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ）和ｏｄＦ２（ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｌａｒｇｅｓｔ ｏｎｓｅｔ ｏＦ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ）颗粒细胞（ｇｒａｎｕｌｅｓａ ｃｅｌｌｓ，ｇｃｓ）构建ｒｎａ文库，ｉｌｌｕｍｉｎａ ｈｉ ｓｅｑ ２０００平台测序；采集屠宰牛双侧卵巢，通过黄体形态特征筛选处于第一卵泡波阶段的最大卵泡和第二．．．

【目的】探讨在水牛中增殖细胞核抗原(PCNA)参与卵泡发生的时期及其在卵巢组织不同时期卵泡中的表达定位;【方法】采用石蜡切片结合免疫组化的方法对PCNA在卵巢组织中进行定位,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)技术检测PCNA在腔前卵泡中的表达情况。【结果】免疫组化结果显示:原始卵泡中的卵母细胞能检测到PCNA的表达,但颗粒细胞并未观察到PCNA的免疫染色;初级卵泡到次级卵泡,卵母细胞和颗粒细胞中均可检测到PCNA的表达,且在颗粒细胞中的表达有增强的趋势;有腔卵泡中,颗粒细胞、卵泡膜细胞及包围卵母细胞的卵丘细胞中都能观察到很强的免疫染色。定量表达检测结果显示:PCNA在原始卵泡、初级卵泡及...

采用组织学和荧光实时定量PCR方法,检测饲喂不同剂量芳香化酶抑制剂来曲唑(letrozole,50、100和200μg/g)对胡子鲇(Clarias fuscus)性腺组织学和性别比率的影响,以及200μg/g来曲唑对性分化前后脑型芳香化酶基因(Cyp19a1b)和翼状螺旋/叉头转录因子2(Foxl2)基因表达的影响,结果表明,50μg/g剂量的来曲唑对胡子鲇性腺分化无显著影响;但100μg/g和200μg/g剂量的来曲唑可促进胡子鲇精巢分化,抑制卵巢分化,卵巢腔最早出现时间和初级卵母细胞出现时间均分别推迟3 d和6 d,而初级精母细胞最早出现时间则分别提前2 d和5 d,且雄性率分别达65....

为了研究鱼类半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)的功能并探索其在水产品加工和病害防治中的应用潜力,将改造后的中华鲟(Acipensersinensis)cystatinCcDNA亚克隆到原核表达载体pBV220,构建表达cystatinC的大肠杆菌基因工程菌。该工程菌经温度诱导、SDS PAGE检测,在约12.4kD处有一特异蛋白带,该特异蛋白的含量约为菌体总蛋白的25%。重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂经洗涤、溶解、透析、复性后纯度为85%,实现了中华鲟cystatinC在大肠杆菌中的高效表达。木瓜蛋白酶活性抑制实验结果表明该重组cystatinC具有明显的酶活抑制作用。

采用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因的cDNA序列。该基因全长1 516 bp,开放阅读框1 245 bp,编码414个氨基酸,其预测分子量为45.06 kD,理论等电点为5.694,并含有两个糖基结合位点。同源性分析发现其与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高,达到49%。组织表达分析表明,serpin基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高,其次是肝胰腺和鳃组织,在肌肉中表达量最低。不同盐度胁迫后脊尾白虾的血细胞serpin基因表达量在盐度胁迫8 h时显著高于对照组(P<0.05),肝胰腺组织中serpi...

Serpin家族成员作为主要的丝氨酸蛋白酶抑制剂,通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的活性来调节蛋白酶级联反应,进而参与了包括血液凝结、补体激活、纤维蛋白溶解、炎症反应、肿瘤抑制和激素转运等大量的基本生物过程,在调节机体免疫及其它重要生理功能等方面发挥着重要作用。在前期研究中,从中国明对虾血细胞中克隆得到一个serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-serpin,GenBank登录号:DQ318857),初步研究显示它在转录水平参与了病原菌和白斑杆状病毒(WSSV)引发的中国明对虾先天免疫应答反应;利用原核重组表达系统,成功获得了重组的中国明对虾serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂(rF...

[目的]本文旨在体外表达纯化灰霉菌的I型肌球蛋白（MyosinI）及筛选抑制剂。[方法]采用SF9昆虫细胞蛋白表达系统表达灰霉菌MyosinI（BcMyosinI）马达结构域，用亲和层析和凝胶过滤层析纯化方法纯化蛋白，用SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白表达情况。从实验室已有的化合物库中，用ATPase活性试剂盒测定化合物对BcMyosin I的酶活性抑制率。采用菌丝生长速率法测定部分化合物对灰霉菌的菌丝生长抑制活性。以禾谷镰刀菌I型肌球蛋白（FgMyosin I）三维结构为模板，同源模建预测BcMyosin I三维结构。用AutoDock-Vina软件将部分化合物与BcMyosin I进行分子对接。[结果] 成功在体外表达纯化BcMyosin I 。20 μmol·L~(-1)条件下，化合物B1和B17对BcMyosin I的酶活性抑制率分别为56.24%和65.39%，显著高于对照药剂氰烯菌酯对酶活的抑制率（27.29%）；B1和B17对灰霉菌的菌丝生长抑制率分别为32.90% 和83.44%，显著高于对照药剂氰烯菌酯对菌丝生长的抑制率（1.06%）。对照药剂氰烯菌酯与BcMyosin I的结合自由能为-7.0 kcal·mol~(-1)，而化合物B1和B17与BcMyosin I的结合自由能分别为-8.5和-8.8 kcal·mol~(-1)，结合自由能越低，说明化合物对BcMyosin I的抑制活性均高于氰烯菌酯。[结论] 成功获得BcMyosin I单体蛋白；筛选出B1和B17两个灰霉菌肌球蛋白抑制剂。

杨树受损伤后能诱导一些基因的表达,其编码的蛋白质可能在杨树的防卫反应中起一定作用。用PCR方法从新疆杨叶片中克隆出一个损伤诱导型Kun itz胰蛋白酶抑制剂基因PaTI1。序列分析表明:此基因不含内含子,其翻译起点上游具有‘TATA’和‘CCAAT’等转录控制元件,包含的阅读框架能编码一个长为213个氨基酸的多肽。此多肽与克隆自美洲山杨的PtTI2和PtTI1氨基酸序列同源性最高,分别为95%和80%,其N端存在一长度为27个氨基酸的信号肽。将此基因以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行表达,纯化后的融合蛋白对胰蛋白酶的活性有抑制作用,每8.5μg融合蛋白可完全抑制1μg牛胰蛋白酶的活性。W est...

克隆决明胰蛋白酶抑制剂2(Cassia obtusifolia trypsin inhibitor 2,COTI2)基因序列,并考察其在不同环境下的表达模式。利用RACE方法克隆了COTI2基因的部分序列,利用定量PCR考察其在盐、低温、干旱及ABA处理下的表达模式。从决明种子c DNA中克隆出了长度为565 bp的基因片段,该片段具有典型的Kunitz蛋白酶抑制剂基因家族的结构域。将得到的序列提交GenBank,序列号为ku745416。对获得的COTI2的氨基酸序列进行比较分析,发现COTI2的P1位

【目的】研究一氧化氮对宰后牦牛肉品质的影响,为牦牛肉品质改善提供理论依据。【方法】以3—5岁去势甘南牦牛肉为材料,取其背最长肌,剔除筋膜、脂肪等,切成大小均匀的薄片(8 cm×8 cm),用20 G针均匀穿刺,分别采用去离子水(对照组)和1、10、100 mmol·L~(-1)一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂(N-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐)在4℃条件下1﹕1(V/m)浸泡肉样1 d,然后在4℃条件下成熟,测定成熟期间(0、1、3、5和7 d)NOS活性与一氧化氮含量、肌原纤维小片化指数(MFI)、总巯基含量、羰基含量、pH、色度等指标。【结果】NOS抑制剂处理后的牦牛背最长肌NOS活性和一氧化氮含量显著降低,成熟第7天时,处理组的NOS活性分别比对照组低30.9%、43.6%、74.7%,一氧化氮含量分别比对照组低4.7%、12.5%、21.5%。处理后的牦牛肉pH显著降低,第7天时,处理组分别比对照组低0.8%、5.7%、15.2%,其中10和100 mmol·L~(-1) NOS抑制剂处理组显著低于对照组。处理显著降低了牦牛肉羰基含量,成熟第7天时,处理组分别比对照组低4.1%、19.0%、22.2%。此外,处理组MFI显著上升,成熟第7天时,处理组分别比对照组低31.1%、23.3%、9.6%。处理组牦牛肉总巯基含量显著上升,第7天时,对照组比NOS抑制剂处理组分别低3.2%、3.7%、2.7%。成熟过程中,NOS抑制剂处理使肉色a~*值显著降低,肉色L~*值显著升高,第7天时,处理组的肉色a~*值分别比对照组低7.1%、40.2%、30.7%,肉色L~*值分别比对照组高1.1%、2.0%、1.1%。【结论】一氧化氮促进宰后牦牛肉蛋白质氧化,抑制牦牛肉嫩化,使肉色L~*值降低,a~*值升高,对宰后牦牛肉的品质产生负面影响,而NOS抑制剂能降低肌肉中NOS活性。

为探索脑型芳香化酶基因(cyp19a1b)在雌核发育三倍体鱼淇河鲫性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆淇河鲫cyp19a1b基因cDNA全长序列,采用Real-time PCR分析其在不同组织、胚胎及胚后不同发育时期的表达情况,同时检测芳香化酶抑制剂Letrozole诱导性逆转及腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后cyp19a1b在脑中的表达情况。结果显示,淇河鲫cyp19a1b cDNA全长2 984 bp(GenBank ID:MF926270),包含132 bp5′非编码区,1 319 bp 3′非编码区,1 533 bp开放读码框,编码510个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,淇河鲫Cyp19a1b与其他鲤科鱼类同源性较高,与哺乳类、爬行类等脊椎动物同源性较低,这与其分类地位一致;组织分布检测结果显示,cyp19a1b基因在淇河鲫脑中表达量最高,在卵巢等其他组织中表达量较低;Realtime PCR结果表明,在胚胎发育过程中cyp19a1b在外源精子刺激后从囊胚期开始上调,神经胚期达到最高,随后降低;出膜后随着发育的进行,该基因在脑中表达量逐步上调,在躯体中一直维持在较低水平;除此之外,伴随着Letrozole诱导的性逆转,cyp19a1b在脑中表达量降低;腹腔注射hCG可以促进cyp19a1b在脑中表达。研究表明,淇河鲫cyp19a1b基因可能通过参与神经系统的形成及神经内分泌活动,在性别决定与分化过程中起到一定的作用。

通过田间埋袋试验,探讨脲酶抑制剂N-丁基硫代磷酰三胺(NBPT)与不同硝化抑制剂双氰胺(DCD)、3-甲基吡啶-1-1羧酰胺(CMP)和4氨基-1,2,4-三唑盐酸盐(ATC)组合对土壤尿素氮转化的影响。结果表明:添加不同硝化抑制剂DCD、CMP、ATC时,均能不同程度减缓尿素水解,并且可推迟尿素水解5d,增加土壤有效N含量,其中添加硝化抑制剂CMP,对土壤NH4+-N和NO3--含量变化、硝化抑制率和土壤总有效N水平的影响最大。

【目的】比较不同硝化抑制剂在石灰性土壤上对氮素转化的抑制效果,旨在选择石灰性土壤上较理想的硝化抑制剂,为进一步提高氮素利用率、减少环境污染提供依据。【方法】以单纯施用尿素为对照,采用室内土壤培养试验法,将硝化抑制剂3,4-二甲基吡唑磷酸(DMPP)、双氰胺(DCD)、2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶(AM)和硫脲(TU)施入土壤,在培养一定时间(1~50 d)后采样,测定土壤的NH4+-N、NO3--N、NO2--N含量及pH和电导率(EC)。【结果】硝化抑制剂DMPP、DCD和AM不仅能够有效延缓尿素的水解,显著抑制土壤中NH4+-N的氧化作用,而且能够较长时间保持较高的NH4+-N含量,使硝...