为了探索miRNA对日本沼虾几丁质酶3A(Macrobrachium nipponense chitinase 3A,MnCHT3A)基因的调控作用,实验采用生物信息学方法预测并筛选与MnCHT3A靶向结合的miRNA—miR-305-5p;利用qRT-PCR、生物化学以及组织学方法,研究了在体条件下,miR-305-5p对靶基因的调控作用。结果显示,一个蜕皮周期中miR-305-5p与MnCHT3A的表达量呈负相关,前者C期最高、A期最低;而MnCHT3A的表达趋势则相反。注射miR-305-5p mimics和miR-305-5p inhibitor后,与对照组相比,MnCHT3A转录水平分别降低60%和升高166%;MnCHT酶活性分别降低39.53%和升高133%。组织学观察发现,C期的头胸甲表皮为3层结构,由外向内依次为上表皮、外表皮和内表皮(H.E染色);几丁质荧光染色结果显示,几丁质分布在内、外表皮;扫描电镜结果清晰显示了内、外表皮的板层结构。与对照组相比,miR-305-5p mimics组内表皮的板层厚度增加,呈蓝色荧光的几丁质条带有增厚趋势;而miR-305-5p inhibitor组表皮结构紊乱,几丁质荧光分布不均且部分区域明显减弱。研究表明,miR-305-5p的靶基因为MnCHT3A,在体条件下,miR-305-5p能够靶向抑制MnCHT3A的转录。

【目的】研究miR-133a在鸡不同组织中的表达情况,对baculoviral IAP repeat containing 5(BIRC5)进行靶基因的试验验证,探讨鸡miR-133a对BIRC5的靶向调控作用。【方法】采用生物信息学方法对miR-133a靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告系统及点突变试验对BIRC5进行靶基因验证,同时运用实时荧光定量PCR检测miR-133a在鸡不同组织中的表达量。【结果】在鸡3′UTR数据库的11 891个基因中预测到287个miR-133a的靶基因;miR-133a在鸡的组织表达谱中显示其在肌肉中的表达量较高,尤其是在骨骼肌中表达量最高;报告基因试验显示...

【目的】通过理论预测与试验验证,旨在揭示miR-433-3p对BCKDHB的调节机制。【方法】利用Target Scan、miRanda和DIANA-micro T 3个在线软件,以BCKDHB的序列预测与BCKDHB有靶标关系的相关miRNAs。为了验证理论上的预测结果,用设计好的BCKDHB 3′-UTR的特异性引物进行PCR扩增,得到目的片段并进行割胶回收和纯化,并将Pmir-GLO与目的片段同时使用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ两个限制性内切酶进行双酶切,再用T4连接酶连接双酶切之后的目的片段和Pmir-

【目的】BCL2L11在哺乳动物中能够促进多种细胞凋亡，同时参与繁殖性状相关组织器官的发育及疾病治疗，文章利用分子生物学方法探究miR-221-3p靶向调控BCL2L11对小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响，为进一步研究BCL2L11在卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁过程中的调控作用提供依据。【方法】在前期课题组卵巢组织全转录组测序分析的基础上，获得了候选基因BCL2L11及其调控元件miR-221-3p，利用半定量和组织荧光定量（RT-qPCR）分析BCL2L11在小尾寒羊不同组织中的表达情况；通过RT-qPCR定量试验在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中鉴定了BCL2L11及miRNA-221-3p的表达情况；构建BCL2L11 3’UTR野生型和突变型载体，在HEK293T细胞中共转染miR-221-3p mimic和BCL2L11野生型和突变型及阴性对照，采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-221-3p与BCL2L11靶向性关系；在绵羊卵巢原代颗粒细胞中转染miR-221-3p mimic及阴性对照实现miR-221-3p过表达，使用RT-qPCR技术在mRNA水平上检测miR-221-3p对BCL2L11以及卵巢颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas表达水平的影响；同时利用EdU试验分析miR-221-3p过表达和阴性对照组中颗粒细胞的增殖变化。【结果】半定量和组织RT-qPCR分析均表明BCL2L11在卵巢组织中表达量高于其他组织；RT-qPCR定量结果显示miR-221-3p和BCL2L11在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中差异表达，miR-221-3p在卵泡期卵巢中的表达量高于黄体期，而BCL2L11在卵泡期卵巢中的表达量低于黄体期，表现出负调控的现象；双荧光素酶报告基因验证分析显示，过表达miR-221-3p mimic显著抑制了BCL2L11 3’UTR荧光素酶的活性（P<0.05）;EdU试验分析显示，过表达miR-221-3p的颗粒细胞增殖率为18.9%，极显著高于阴性对照组的10.43%(P<0.01)。【结论】BCL2L11和miR-221-3p是调控绵羊卵巢发育的重要基因及调控元件，BCL2L11是miR-221-3p的靶基因之一，miR-221-3p过表达可抑制颗粒细胞凋亡，该作用结果可能通过抑制靶基因BCL2L11的表达进而影响了绵羊卵巢颗粒细胞的凋亡。

为了研究miR-130c-5p在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)感染中潜在靶基因g的靶向关系以及对病毒复制的影响，本研究以斑点叉尾鮰卵巢(channel catfish ovary, CCO)为实验材料，通过实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)技术测定SHVV不同感染时间和感染剂量条件下，病毒基因水平和蛋白水平以及miR-130c-5p变化情况。此外，将SHVV的g基因上miR-130c-5p对应的靶序列克隆到质粒pmirGLO，构建质粒pmirGLO-G用于双荧光素酶报告实验进行靶基因验证。结果显示，随着SHVV感染时间及剂量的不断增加，miR-130c-5p和g基因的表达水平都显著上调。进一步实验证明，miR-130c-5p类似物和pmirGLO-G质粒共转染可显著抑制荧光素酶活性强度，而转染miR-130c-5p抑制剂则明显上调了pmirGLO-G报告载体的荧光信号。此外，miR-130c-5p的过表达显著降低了病毒g基因的mRNA及蛋白表达，而抑制miR-130c-5p的表达则上调了g基因的mRNA及蛋白的表达水平。研究结果表明，miR-130c-5p通过靶向SHVV的g基因，引起G蛋白的降解，从而抑制SHVV的增殖。本研究结果为理解microRNA调控SHVV的致病机制提供了重要基础，为抗SHVV疫苗等药物的研发提供了理论支持。

【背景】卵泡颗粒细胞（Granulosa cells,GCs）凋亡是导致卵泡闭锁的重要原因，竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ce RNA）机制已被证明参与调控GCs的凋亡过程。前期牦牛卵巢转录组测序发现lnc RNA-MSTRG.7889.1与bta-mi R-146a具有结合位点，而bta-mi R-146a和Smad4存在靶向关系。【目的】通过探究影响牦牛卵泡GCs凋亡的ce RNA分子调控机制，为揭示牦牛生殖调控的奥秘奠定基础。【方法】采集和分离成年母牦牛的健康和闭锁卵泡，利用RT-q PCR法检测lnc RNA-MSTRG.7889.1、bta-mi R-146a和Smad4在卵泡中的表达。制作牦牛健康和闭锁卵泡组织切片，TUNEL检测健康卵泡和闭锁卵泡中GCs的凋亡情况；荧光原位杂交分析lnc RNA-MSTRG.7889.1、bta-mi R-146a和Smad4在卵泡中的定位。体外分离和培养牦牛GCs，分别转染Smad4过表达载体和bta-mi R-146a mimics，流式细胞术检测GCs细胞凋亡率，Western blot检测促凋亡蛋白CASPASE3和BAX，抑凋亡蛋白BCL-2的表达；GCs共转染Smad4过表达载体和bta-mi R-146a mimics后，探究bta-mi R-146a是否靶向Smad4影响牦牛GCs的凋亡。将lnc RNA-MSTRG.7889.1过表达慢病毒载体感染GCs，流式细胞术和Western blot检测lnc RNA-MSTRG.7889.1对GCs凋亡的影响；lnc RNA-MSTRG.7889.1载体和bta-mi R-146a mimics共转染GCs，进一步分析lnc RNA-MSTRG.7889.1是否竞争性结合bta-mi R-146a靶向Smad4影响牦牛GCs的凋亡。【结果】lnc RNA-MSTRG.7889.1和Smad4 m RNA在牦牛健康卵泡中的表达极显著高于闭锁卵泡（P<0.01），而bta-mi R-146a的表达则相反（P<0.01）。TUNEL检测结果显示，在闭锁卵泡中GCs的荧光强度极显著高于健康卵泡（P<0.01），说明闭锁卵泡中GCs凋亡显著高于健康卵泡。荧光原位杂交结果显示Smad4、bta-mi R-146a和lnc RNA-MSTRG.7889.1在牦牛卵泡中共表达，其在健康和闭锁卵泡中的表达与RT-q PCR结果基本一致，提示可能存在ce RNA机制参与牦牛健康卵泡发育和卵泡闭锁过程。在牦牛GCs过表达Smad4使细胞凋亡率显著降低（P<0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著降低（P<0.01),BCL-2蛋白的表达显著升高（P<0.01）；过表达bta-mi R-146a使GCs凋亡率显著升高（P<0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著升高（P<0.01),BCL-2蛋白的表达显著降低（P<0.01);bta-mi R-146a靶向抑制Smad4的表达（P<0.01);Smad4和bta-mi R-146a共转染GCs，结果显示bta-mi R-146a靶向抑制Smad4降低前者对GCs凋亡的促进作用（P<0.01）。过表达lnc RNA-MSTRG.7889.1使牦牛GCs凋亡率显著降低（P<0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著降低（P<0.01),BCL-2蛋白的表达显著升高（P<0.01);lnc RNA-MSTRG.7889.1显著抑制bta-mi R-146a的表达（P<0.01）。将lnc RNA-MSTRG.7889.1和bta-mi R-146a共转染GCs，结果表明lnc RNA-MSTRG.7889.1靶向bta-mi R-146a降低后者对GCs凋亡的促进作用（P<0.01）；而且RT-q PCR法和Western blot检测结果表明lnc RNA-MSTRG7889.1竞争性结合bta-mi R-146a促进Smad4 m RNA和蛋白水平的表达（P<0.01）。【结论】lnc RNA-MSTRG.7889.1竞争性结合bta-mi R-146a促进Smad4的表达抑制牦牛GCs的凋亡。

为探究miR-462在嗜水气单胞菌感染草鱼肾脏细胞(Ctenopharyngodon idella kideny, CIK)后的调控机制，实验利用荧光定量技术检测了CIK细胞感染嗜水气单胞菌后miR-462的表达水平变化；运用RNAhybrid软件预测miR-462的靶基因，利用双荧光素酶报告基因系统进行确定；此外还分析了miR-462对靶基因下游基因的调控作用。结果发现，CIK细胞感染嗜水气单胞菌过程中，miR-462的表达发生显著变化；cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达先降低后升高，与miR-462的表达模式呈负相关。双荧光素酶报告系统显示miR-462可靶向cx32.2、slc9a3.1和tbk1的3’非编码区抑制其表达，过表达miR-462可以显著抑制cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达。转染miR-462模拟物后，下游slc4a4a、tnfrsf5、cxcl9和cxcl11基因的表达量受到抑制。研究表明，miR-462参与调控嗜水气单胞菌感染后草鱼CIK细胞中的免疫应答。cx32.2、slc9a3.1和tbk1被鉴定为miR-462的靶基因。miR-462可通过靶向slc9a3.1和tbk1影响下游基因的功能。

为了探究miR-17a-5p在鲢低氧胁迫下的功能，在前期鲢small RNA测序的基础上对鲢miR-17a-5p进行靶基因预测及功能富集分析，通过双荧光素酶活性验证其与HIF-1α的靶向关系，并检测低氧胁迫下miR-17a-5p和其靶基因在鲢肝脏、脑、心脏和鳃四个组织中的动态表达特征。结果显示，鲢miR-17a-5p在不同物种间高度保守，预测出381个miR-17a-5p的潜在靶基因显著富集在硫代谢、mTOR信号通路以及萜类骨架的生物合成3个KEGG信号通路上。miR-17a-5p可与HIF-1α mRNA的3′UTR结合，并降低HIF-1α mRNA水平，低氧胁迫下miR-17a-5p的表达呈下降趋势，而HIF-1α表达则呈上升趋势；3个显著富集KEGG通路中的11个miR-17a-5p潜在靶基因在低氧胁迫过程中的不同组织中的表达，尤其是肝脏中的表达，除SGK1外，均呈显著上升趋势。研究表明，低氧胁迫下鲢各组织中miR-17a-5p的表达下调减弱了其对靶基因的抑制作用，进而导致HIF-1α、ddit4和Lrp5等响应低氧胁迫的基因表达上调。本研究为低氧胁迫下鲢miRNA的表达与调控机制提供新见解，也为培育耐低氧的鲢新品系(种)提供了参考。

【目的】预测和验证羊驼TGF-β1是mi R-663的靶基因之一,并对mi R-663介导的TGF-β1在黑色素生成过程中的作用进行研究。【方法】利用Targetscan、RNAhybrid和RNA22在线预测mi R-663的靶基因,并对靶基因3′UTR区可能的mi R-663的作用位点进行分析。利用DNAMAN软件分析比对羊驼、人和牛等哺乳动物TGF-β1-3′UTR区的相似性。利用SacⅠ和XbaⅠ将羊驼TGF-β1基因的3′UTR区插入pmir GLO构建双荧光报告载体pmir GLO-TGF-β1-3′UTR并与mi R-663 mimic共转染293T细胞,通过测定荧光素酶活性来验...

牙鲆(Paralichthysolivaceus)是研究鱼类变态发育的理想模型,其右眼移位及生活习性的改变受甲状腺激素(TH)调控。同时microRNA (miRNAs)在变态期间发挥关键性作用。为研究TH、pol-miR-124及Otx2在牙鲆变态中的调控机制,本实验通过生物信息学方法预测pol-miR-124潜在靶基因Otx2,首先利用qRT-PCR检测在牙鲆各组织、正常变态及外源TH处理仔鱼后pol-miR-124和Otx2的表达模式。然后克隆400bp含有"种子序列"的Otx23′UTR区序列,构建野生型重组载体pmirGLO-Otx2并转染293T细胞检测双荧光素酶活性确定靶向关系。qRT-PCR结果表明:pol-miR-124和Otx2均在脑和眼睛组织中特异性高表达;在仔鱼变态28 dph表达量最高与变态进程相一致; TH作用下,在20 dph、24 dph时期, pol-miR-124的表达量低于正常组,而Otx2的表达量高于正常组;在28 dph、32dph、36dph时期,pol-miR-124的表达量高于正常组,但Otx2的表达量低于正常组,两者呈现出相反的表达趋势;双荧光素酶结果显示pol-miR-124靶向负调控Otx2。本实验旨为揭示牙鲆视觉感光系统的发育机制奠定研究基础,同时为探讨牙鲆变态发育机制提供了新的理论依据。

【目的】研究红花ｍｉＲ３９７ａ前体基因及成熟基因在红花不同组织中的表达水平，并对ｍｉＲ３９７ａ基因序列、靶基因及基因功能进行分析，为深入研究红花抗逆机制提供参考。【方法】提取红花籽粒、花瓣、茎、根、叶片等５个组织材料的总ＲＮａ，使用荧光定量ＰＣＲ鉴定ｍｉＲ３９７ａ在不同组织中的表达水平；利用生物信息学方法分析红花ｍｉＲ３９７ａ基因序列，用原生质体转化方法验证红花ｍｉＲ３９７ａ调控的靶基因ＬａＣ２，并利用转基因拟南芥表型研究ｍｉＲ３９７ａ基因的功能。【结果】ｍｉＲ３９７ａ前体基因和成熟基因均能在红花不同组织中表达，且均以叶片组织中的表达量最高，分别是籽粒组织的２．５与１．９倍，差异达极显著水平；．．．

为了研究牙鲆白化发生过程中的分子调控机制,本研究在获得正常和白化牙鲆转录组及micro RNA(miRNA)深度测序数据的基础上,对tyrosinase related protein 1(Tyrp1)和mmu-miR-143-5p_R+2(mmu-143)进行了表达模式、靶基因预测及验证分析。首先通过RACE方法克隆得到白化相关基因Tyrp1的2个转录本,进化树分析表明这2个转录本分别是Tyrp1a和Tyrp1b,利用RNAhybrid软件预测到mmu-143可能与Tyrp1a基因存在互作关系,通过双荧

为了研究牙鲆白化发生过程中的分子调控机制,本研究在获得正常和白化牙鲆转录组及micro RNA(miRNA)深度测序数据的基础上,对tyrosinase related protein 1(Tyrp1)和mmu-miR-143-5p_R+2(mmu-143)进行了表达模式、靶基因预测及验证分析。首先通过RACE方法克隆得到白化相关基因Tyrp1的2个转录本,进化树分析表明这2个转录本分别是Tyrp1a和Tyrp1b,利用RNAhybrid软件预测到mmu-143可能与Tyrp1a基因存在互作关系,通过双荧

为研究miR-155在柱状黄杆菌胞外多糖(FC-EPS)诱导的细胞凋亡中的作用机制，本实验采用RNA干扰(RNAi)技术，通过过表达miR-155和敲降踝蛋白基因(talin-1)，皆能抑制FC-EPS诱导的细胞凋亡，并鉴定出talin-1为miR-155的靶蛋白。在FC-EPS诱导细胞凋亡的过程中，踝蛋白水平显著升高，在凋亡发生阶段检测到凋亡执行蛋白Caspase-3的活化，同时检测到2条踝蛋白剪切异构体，大小分别约为200 ku和250 ku；将构建的鲤Talin-1真核表达质粒转染鲤上皮瘤细胞(EPC)，过表达的Talin-1延迟且延长了细胞凋亡的进程，并检测到上述2条踝蛋白异构体。然而，当以FC-EPS转染EPC细胞时，Talin-1先下降再恢复到正常水平，细胞不发生凋亡。因此，在FC-EPS诱导细胞凋亡的过程中，细胞通过上调miR-155来调控靶基因talin-1 mRNA和蛋白转录的变化，以及产生Talin-1蛋白异构体来抑制细胞发生凋亡。本研究为有效防治柱状黄杆菌疾病提供新思路。

【目的】探明miR-7与CTSK基因相互作用关系及其对贵州黑山羊卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响，为贵州黑山羊优良品种保藏、选育与开发利用提供依据。【方法】采用在线数据库筛选miR-7与CTSK基因3＇UTR的结合靶点，通过将CTSK基因3＇UTR插入双荧光素酶报告系统中进行互作位点检测；采用CCK-8和划痕试验检测miR-7是否靶向调控CTSK基因影响贵州黑山羊卵巢颗粒细胞的增殖和迁移；过表达miR-7后采用RT-qPCR检测其对促增殖蛋白PCNA、抗凋亡蛋白BCL2和促凋亡相关蛋白BAX、caspase-3、caspase-9表达水平的影响。【结果】成功构建CTSK基因3＇-UTR 2个预测靶点的野生型和突变型双荧光素酶报告载体；双荧光素酶试验结果表明CTSK基因3＇UTR区的2个预测靶位点均受miR-7调控；CCK-8和细胞划痕结果表明：转染miR-7试验组的卵巢颗粒细胞增殖和迁移能力均显著高于对照(NC)组；RT-qPCR结果表明：上调miR-7能极显著上调PCNA和BCL2的表达，抑制BAX、caspase-3和caspase-9的表达。【结论】miR-7可以靶向结合CTSK的3＇UTR区2个靶位点并极显著抑制CTSK基因的表达；过表达miR-7可以显著促进贵州黑山羊卵巢颗粒细胞增殖和迁移能力，并促进增殖标志基因、抗凋亡基因的表达和抑制促凋亡相关基因的表达。研究结果可为进一步研究miR-7靶向调控CTSK表达影响贵州黑山羊繁殖性能的分子机制提供理论依据。