【目的】从土壤宏基因组中克隆新的抗草甘膦新基因,并对其功能进行验证,为培育抗除草剂转基因新品种奠定基础。【方法】利用被草甘膦污染的土壤建立宏基因组文库,经筛选从中成功克隆了一个新的具有草甘膦抗性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因(命名为soilA)。构建了Prrn启动子驱动soilA基因的原核表达载体pSYTH-soilA,将其导入大肠杆菌进行原核草甘膦抗性试验,构建了35S启动子驱动soilA基因的植物表达载体pC330E,利用农杆菌介导法转化烟草,并对经PCR和胶体金试纸条鉴定的转基因烟草植株进行草甘膦耐受能力检测。【结果】序列分析表明,所获得的soilA基因长1 34...

【目的】通过宏基因组技术获取土壤微生物总DNA,运用基因克隆、功能筛选、基因表达等手段挖掘新型β-葡萄糖苷酶,为新型微生物资源的开发利用提供科学依据。【方法】提取高糖土壤宏基因组DNA,构建宏基因组文库;筛选文库并对阳性克隆子亚克隆,获得β-葡萄糖苷酶基因;PCR扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌进行表达;采用镍亲和层析对重组酶纯化,研究其酶学性质。【结果】成功构建约含9.2万个克隆的高糖土壤宏基因组文库,获得一个新型β-葡萄糖苷酶基因unbgl3A。该基因大小为2241 bp,在氨基酸水平上,与Gen Bank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的一致性为73%;该酶最适pH为6.0,最适温度为50℃,对对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)的K_m值为6.45 m M,V_(max)为50μmol/(mg·min)。在15～50℃热处理1 h后仍保留90%以上的酶活力,热稳定性较好,且被多种糖激活。【结论】宏基因组技术是获取新酶有效手段,获得的Unbgl3A具有良好酶学性质,可为进一步挖掘其应用潜力及研究耐热机理奠定基础。

【目的】由于草甘膦在农业生产中的广泛使用,抗草甘膦转基因作物的研究一直是转基因作物研究的热点,其中草甘膦抗性功能新基因的挖掘是核心问题。自然界中微生物种类繁多,基因资源丰富,论文拟从广东地区农田土壤中筛选和鉴定出高抗草甘膦菌株,克隆其草甘膦靶标酶基因并进行抗性水平验证,以期获得高抗草甘膦新基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。【方法】用含有浓度梯度草甘膦的选择培养基从备选土壤中筛选出具有高抗草甘膦特性的菌株;通过显微观察、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析结果对菌株种类进行鉴定;利用RT-PCR技术克隆该菌株的草甘膦靶标酶基因aroAS001,并通过序列比对和系统发育树分析aroAS001...

[目的]本文旨在研究土壤宏基因组来源的新型四环素破坏酶Tet(64)的耐药机制并分析tet(64)的基因环境，为tet(64)基因的传播及抗生素和佐剂的研发奠定基础。[方法]利用体外生化反应验证Tet(64)降解四环素的功能，通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析降解产物，结合序列比对、系统发育树构建、分子对接等生物信息学方法推测Tet(64)中与四环素结合的重要氨基酸残基，解析Tet(64)的耐药机制和tet(64)基因的水平转移风险。[结果]MQ776克隆的序列分析发现tet(64)上游存在IS1插入序列，暗示tet(64)基因具有潜在的水平转移风险。Tet(64)属于黄素依赖型单加氧酶，与首次发现的四环素破坏酶Tet(X)仅有18.93%的序列一致性，与最近发现的一系列土壤来源四环素破坏酶Tet(47)—Tet(56)也只有70%左右的序列一致性。SWISS-MODEL三维建模发现Tet(64)与土壤来源的Tet(50)具有相似的结构，包含1个四环素结合域、1个FAD结合域以及连接上述2个结构域的2个α-螺旋。体外生化试验发现Tet(64)降解四环素后产生了2个特异产物，m/z均为461.0,与Tet(X)催化产物一致。推测反应中四环素C11a位点被羟基化，破坏了C11和C12组成的β-二酮区域，导致四环素不能螯合镁离子而失去抗菌活性。[结论]鉴定了土壤来源的新型四环素破坏酶Tet(64)的四环素降解功能，初步解析了Tet(64)的耐药机制。

[目的]本文旨在挖掘土壤微生物宏基因组(environmental DNA,eDNA)中的Ⅱ型聚酮化合物酮基合成酶基因(ketosynthase alpha,KS_α),并依据获得的KS_α基因与化合物结构的关系初步预测其所在基因簇可能合成的Ⅱ型聚酮化合物种类。[方法]利用Ⅱ型聚酮合酶基因KS_α保守区域设计简并引物筛选珠穆朗玛峰及峨眉山土壤宏基因组文库,对筛选得到的KS_α基因片段进行测序,并与已知Ⅱ型聚酮化合物KS_α基因、孢子色素基因的氨基酸序列用邻接法构建系统发生树,以大肠杆菌的fabB基因作为系统发生树的外群。[结果]总共筛选得到28个珠峰文库来源的KS_α基因,11个峨眉山文库来源的KS_α基因。将这些KS_α基因的氨基酸序列与34种编码已知Ⅱ型聚酮化合物KS_α基因和5种聚酮化合物孢子色素KS_α基因的氨基酸序列构建系统发生树,结果显示许多eDNA来源的KS_α基因与已知聚酮化合物的KS_α基因的氨基酸序列相似性较低,并且除在不同Ⅱ型聚酮结构类型对应的KS_α基因分支中均有分布外,有些eDNA来源KS_α基因在系统发生树中形成了独立的一个分支。[结论]利用宏基因组学方法可以获得新的KS_α基因,通过新基因与已知KS_α基因的同源比对,可以预测新基因所合成化合物的新颖性,为新化合物的发现奠定基础。

【目的】甘蓝(Brassica oleracea L.)是世界上最广泛种植的蔬菜作物之一,其种植已由春、秋两季种植转变为四季栽培,因此,研究甘蓝对光温的反应能力是品种改良的重要基础。光敏色素是植物最重要的一类光受体,主要响应远红光和红光的变化,其中,光敏色素B是红光的最主要受体,与光形态建成、避荫性以及生物产量等性状密切相关。克隆甘蓝的光敏色素B基因(Bo PHYB),在拟南芥中验证异源基因Bo PHYB在光形态建成和避荫性反应中的作用,丰富植物光敏色素基因功能研究,评价光敏色素在甘蓝品种改良中应用的潜在价值。【方法】利用RT-PCR的方法克隆、测序验证得到甘蓝自交不亲和系12C的Bo PHY...

为培育高抗草甘膦作物以应对草甘膦杂草进化，从海洋细菌中筛选到1株高抗草甘膦的盐单胞菌属菌株（Halomonas sp.），通过基因组测序及生物信息学分析，确定该菌株的EPSPS基因，在Escherichia coli(DE3)中对fHoEPSPS、mfHoEPSPS(G384A位点突变)和mHoEPSPS(mfHoEPSPS N端缺失PDT)进行重组表达和纯化，并运用自切割肽LP4/2A介导的基因聚合策略，将抗草铵膦的酶（Repat）置于mHoEPSPS的N端，构建了双抗草甘/铵膦酶（RLH），将其编码基因导入烟草后赋予草甘/铵膦复合抗性。结果显示，该菌株的EPSPS基因（fHoEPSPS）可编码一个N段融合了预苯酸脱水酶（PDT）的双功能酶。草甘膦抗性分析显示mfHoEPSPS的抗性比fHoEPSPS提高了19倍，将mHoEPSPS基因导入烟草后可赋予烟草3倍推荐剂量的草甘膦耐受性，转RLH基因的烟草能够耐受3～5倍推荐剂量的草甘/铵膦复合除草剂。结果表明，源于Halomonas sp.的抗草甘膦EPSPS是一种新型草甘膦耐受酶，通过G384A的位点突变可提高酶活；利用自切割肽介导的基因堆叠策略获得的转RLH基因烟草表现出较高草甘/铵膦复合抗性。

【目的】MYBL2负调控拟南芥花青素和原花青素的生物合成。从芸薹属6个物种的不同叶色材料中克隆MYBL2基因，分析其序列和表达模式，探究其在芸薹属植物花青素生物合成途径中的功能，为油菜的品质、抗逆性、观赏性等性状改良提供参考。【方法】以芸薹属6个物种19份供试材料的总DNA为模板，同源克隆MYBL2基因，并进行多序列比对和进化树分析；对白菜、甘蓝型油菜、芥菜型油菜以及埃塞俄比亚芥的紫叶材料进行遮光处理，结合转录组和qRT-PCR分析MYBL2基因表达水平；对甘蓝、甘蓝型油菜、芥菜型油菜以及埃塞俄比亚芥紫、绿叶材料进行qRT-PCR分析MYBL2基因表达水平；根据克隆MYBL2-1和MYBL2-2序列的核苷酸变异位点设计特异性引物，开发能够区分MYBL2基因组来源的PCR标记。【结果】克隆获得MYBL2-1和MYBL2-2各9个同源基因共56个拷贝。其中，BcaMYBL2-1为首次获得，BcaMYBL2-1编码区序列全长为867 bp，包含2个内含子，分别为168和102 bp，编码198个氨基酸，分子量为22.69 kD，等电点（pI）为8.72。序列比对和进化分析表明，BcaMYBL2-1来源于B基因组。芸薹属6个物种MYBL2-1和MYBL2-2同源基因中，仅BraA07.MYBL2-1、BolC06.MYBL2-1和BcaMYBL2-1在不同叶色材料中存在序列差异。经遮光处理后，紫叶材料叶色变浅，在白菜紫宝5号中，BraA07.MYBL2-1和BraA02.MYBL2-2表达量分别为未遮光部分的0.7和0.4倍；在紫叶白花甘蓝型油菜中，BnaA07.MYBL2-1、BnaC06.MYBL2-1、BnaA02.MYBL2-2和BnaC02.MYBL2-2表达量分别为未遮光部分的0.4、0.5、0.4和0.4倍；在紫叶芥中，BjuA07.MYBL2-1、BjuB03.MYBL2-1、BjuA02.MYBL2-2和BjuB05.MYBL2-2表达量分别为未遮光部分的0.4、0.3、0.4和0.2倍；在紫秆埃芥中，BcaMYBL2-1、BcaB03.MYBL2-1和BcaC03.MYBL2-2表达量分别为未遮光部分的0.3、0.4和0.5倍，而BcaB05.MYBL2-2表达量为未遮光部分的2.4倍。对比芸薹属不同叶色材料MYBL2基因表达情况，结果表明，除了羽衣甘蓝，在紫叶材料中MYBL2基因大部分同源基因的表达量均高于绿叶。在羽衣甘蓝中，绿叶羽衣甘蓝BolC06.MYBL2-1和BolC02.MYBL2-2的表达量分别为紫叶羽衣甘蓝的2.5和3.5倍；在甘蓝型油菜中，紫叶白花BnaA07.MYBL2-1、BnaC06.MYBL2-1和BnaC02.MYBL2-2的表达量分别为绿叶白花的7.5、8.6和26.0倍，而绿叶白花BnaA02.MYBL2-2的表达量为紫叶白花的13.0倍；在芥菜型油菜中，紫叶芥BjuA07.MYBL2-1、BjuB03.MYBL2-1、BjuA02.MYBL2-2和BjuB05.MYBL2-2的表达量分别为四川黄籽的8.3、11.8、23.2和14.6倍；在埃塞俄比亚芥中，紫秆埃芥BcaMYBL2-1、BcaB03.MYBL2-1的表达量分别为W-BCDH76的7.1和27.6倍，而W-BCDH76的BcaB05.MYBL2-2和BcaC03.MYBL2-2的表达量则分别为紫秆埃芥的2.8和5.0倍。依据克隆的基因序列设计出5对引物，可以有效鉴别芸薹属植物MYBL2基因的A、B、C基因组来源。【结论】芸薹属紫叶材料MYBL2基因的表达与光照密切相关，而且参与花青素生物合成的调控机制与拟南芥MYBL2负调控花青素生物合成的机制有所不同。

以蒙古冰草DNA为模板,采用PCR扩增的方法从蒙古冰草(Agropyron mongolicumKeng)中分离得到了一个类反转录转座子基因序列,命名为MwRRT(GenBank:GQ855806.1)。序列分析结果表明:该序列长为1 005 bp,包含780 bp的开放阅读框,编码260个氨基酸。经GenBank中BLAST程序分析表明,该片段98~255处氨基酸与水稻(Oryza sativa)预测逆转录转座子蛋白Ty3-gypsy亚类、预测种属特异抗原—聚合酶(Gag-Pol)前体和预测聚合酶氨基酸同源性为47%;与高粱(Sorghum bicolor)的预测GAG-POL前体氨基酸同源...

为进一步挖掘小麦春化相关基因,探明小麦春化发育调控机制,从不同春化发育特性小麦品种春化响应转录组高通量测序结果中筛选并克隆到1个EST序列,命名为Trx59,该基因的开放阅读框为372 bp,编码124个氨基酸,保守结构域分析显示,Trx59基因有1个Thioredoxin结构域。利用qRT-PCR分析了在春化处理过程中Trx59基因在不同春化发育特性小麦品种的表达特性,并利用VIGS技术进行基因功能的初步验证。结果表明:随着春化处理时间的延长,Trx59基因的表达量逐渐升高,从表达量和表达时间来看,Tr

长叶红砂(Reaumuria trigyna)是一种珍稀泌盐盐生植物,其特有的盐腺结构是长叶红砂适应盐渍荒漠环境的关键,膜泡运输参与该植物的盐腺分泌过程。本研究基于盐胁迫下长叶红砂的转录组数据,克隆获得膜泡运输相关基因RtVAMP2-2。生物信息学分析发现,RtVAMP2-2基因的开放阅读框为1 074 bp,编码357个氨基酸;亚细胞定位和表达特性分析表明,该基因定位于细胞质膜,其表达受盐胁迫诱导;构建植物表达载体,将RtVAMP2-2基因转入拟南芥(Arabidopsis thaliana)中进行功能鉴定,结果显示,转基因拟南芥呈现盐敏感的表型,推测RtVAMP2-2基因可能在植物耐盐中发挥负调控作用。

【目的】克隆胡杨木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因PeXTH,并研究该基因和植物抗Cd2+性之间的关系。【方法】利用RT-PCR方法从胡杨中克隆一个木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因PeXTH,将该基因的全长cDNA克隆到植物表达载体pGreen0029上,然后通过农杆菌介导法,将重组表达载体转入烟草,并对转基因烟草的抗Cd2+能力进行初步分析。【结果】PeXTH基因的开放阅读框(ORF)长867bp,含ATG起始密码子和TAG终止密码子,编码由288个氨基酸组成的蛋白;多重氨基酸序列比对结果显示,PeXTH蛋白含有木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTHs)的保守催化活性域DEIDFEFLG和N-糖基化位...

[目的]本文旨在筛选土壤微生物来源的芳香聚酮抗生素。[方法]通过宏基因组学技术,利用基于酮基合成酶基因(KSα)保守序列设计的简并引物筛选土壤宏基因组文库,获得含有芳香聚酮生物合成基因簇的阳性克隆。对阳性克隆质粒测序并通过BLASTx同源比对分析其所包含的芳香聚酮生物合成基因簇。通过接合转移方法将基因簇整合进异源表达宿主白色链霉菌基因组中,培养发酵接合子,利用高效液相色谱技术确定克隆特异性产物并对发酵产物进行抑菌活性检测。[结果]从珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库第493号混合文库中扩增得到了1个KSα片段ZF493,蛋白序列分析显示其与酮基合成酶同源,文库筛选得到了含有其对应芳香聚酮生物合成基因簇的阳性克隆cos493。对cos493的测序分析显示其插入片段大小为34 kb,包括酮基合成酶基因(KSα,orf 21)、链长因子基因(KSβ,orf 20)、酰基载体蛋白基因(ACP,orf 19)、环化酶基因(CYC,orf 17和orf 18)、糖基转移酶基因(orf 12)、单加氧酶基因(orf 16)等芳香聚酮合成相关基因。ORF 21与化合物calixanthomycin A聚酮合酶的KSα有67%的相似性,ORF 20与化合物griseorhodin A的KSβ有49%的相似性。通过接合转移使含芳香聚酮合酶基因簇的cos493整合进白色链霉菌宿主基因组中。高效液相色谱分析发酵粗提物发现了2个克隆特异化合物峰,紫外光谱分析显示化合物1在223、296和420 nm处有特征吸收峰,化合物2在214、261和447 nm处有特征吸收峰,特异峰具备芳香聚酮化合物的紫外吸收特征。对发酵粗提物的抑菌活性检测发现,其对金黄色葡萄球菌有抑制作用。[结论]本研究运用基于序列的宏基因组学技术,在链霉菌宿主中表达了来源于土壤微生物的芳香聚酮合酶基因簇并产生了具有抗菌活性的化合物。

【目的】克隆新麦草分蘖关键基因YUCCA并明确其表达特性,为该基因功能验证和育种利用奠定基础。【方法】以不同分蘖类型的新麦草分蘖节为材料,采用PCR法克隆新麦草YUCCA基因并进行同源序列比对,构建1300-c YFP-YUCCA过表达载体,利用烟草瞬时转染及蛋白质印迹法分析新麦草YUCCA蛋白的表达位置及表达情况,通过RNA-Seq数据及q RT-PCR分析验证YUCCA基因的相对表达量。【结果】成功克隆了新麦草YUCCA基因全长,大小为1 336 bp,最大阅读框为1 236 bp,并成功构建了1300-c YFP-YUCCA过表达载体。多序列比对结果显示,新麦草YUCCA主要与麦类作物的亲缘关系较近。表达特性分析发现,YUCCA基因在多分蘖型新麦草中的相对表达量远低于少分蘖型新麦草;与叶、根等组织相比,YUCCA基因在分蘖节中的相对表达量最高。烟草瞬时转化和蛋白质印迹法分析均显示,YUCCA蛋白可以正常表达,其亚细胞定位于细胞质中。【结论】YUCCA基因在调控新麦草分蘖中起下调作用,可用于后续YUCCA基因功能的研究。

Myf5是生肌调节因子家族成员之一。为研究该基因在大口黑鲈(Micropterus salmoide)肌肉生长发育中的作用,运用RT-PCR和RACE技术获得大口黑鲈Myf5 cDNA序列1093bp,其中开放阅读框长723bp,编码240个氨基酸,经分析该蛋白无信号肽序列,属核蛋白,含有一典型的碱性螺旋-环-螺旋结构域。使用Genome walker技术获得启动子区序列2690bp,预测含有肌肉特异性转录调控相关元件:E-框、肌细胞特异增强子2(MEF2)、核转录因子1(SP1)、上游激活因子(USF)、血清应答因子(SRF)等结合位点。含有早期生长应答因子α(EGRα)、早期快反应生长应答...