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[期刊] 渔业科学进展
[作者]
杨珍珍 边力 张岩 常青 陈四清 刘长琳 葛建龙 胡建成 张盛农
本研究采用RACE末端扩增方法,得到全长为3872bp的圆斑星鲽(Verasper variegatus)piwil2基因序列,命名为Vvpiwil2,开放阅读框(ORF)长为3192bp,编码1063个氨基酸,5’-UTR和3’-UTR的长度分别140 bp和540 bp。基于ExPASy、SMART、Signal4.1和NCBI的保守结构域(CDD)数据库在线分析对蛋白序列结构进行预测,推断Vvpiwil2编码的氨基酸分子量为118.6 kDa,理论等电点为9.02,无跨膜结构及信号肽,有3个结构域:ArgoL1结构域、PAZ结构域及PIWI结构域。利用实时荧光定量PCR技术对圆斑星鲽不同发育时期的胚胎、仔稚鱼以及雌雄成鱼的不同组织表达模式进行分析。结果显示,Vvpiwil2基因从胚胎发育早期至高囊胚期均大量表达,之后呈下降趋势,直至孵化阶段。由于胚胎从卵裂至囊胚时期的发育过程主要受细胞质成分引导,直至原肠早期,mRNA开始大量转录合成,实现由母源型向合子型的过渡,推断Vvpiwil2是母源性基因。孵化后仔稚鱼68 d时,Vvpiwil2基因表达量显著高于其他时期,表明Vvpiwil2的功能可能与圆斑星鲽性腺分化过程相关;Vvpiwil2基因在雌雄成鱼性腺中的表达量显著高于其他组织,且卵巢中的表达量显著高于精巢,推测Vvpiwil2基因在卵巢功能的维持中发挥重要作用。本研究结果为解析圆斑星鲽性别决定机制提供了新的靶标基因,为建立全雌化苗种繁育技术打下坚实的理论基础。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张乐乐 边力 常青 侯吉伦 陈四清 赵庆 刘琨 葛建龙 刘长琳
本研究筛选到圆斑星鲽(Verasper variegatus)的性别相关基因sox9,并通过RACE技术获得了全长序列,基因全长为3287 bp,包括1431 bp的ORF,编码477个氨基酸,368 bp的5’UTR和1488 bp的3’UTR。在3’UTR中有多聚腺苷酸尾和加尾信号AATAAA。通过荧光定量PCR测定了sox9基因在圆斑星鲽成鱼不同组织中的表达水平,发现sox9基因在圆斑星鲽的脑、眼、鳃、心、肝、胆、肠、精巢、卵巢、肾和肌肉等各个组织中都有不同程度的表达。在鳃、脑和精巢组织中检测到较高水平的sox9转录,其中精巢中的转录水平显著高于其他组织,sox9基因在性腺中的表达显示出性别两相性差异。其在精巢中的表达水平要显著高于卵巢,说明sox9基因与雄性性腺发育相关。通过测定sox9基因在圆斑星鲽幼鱼不同发育时期(20、30、40、50、60、70和80日龄)的表达水平,发现其在20～50日龄表达量逐渐下降,在60日龄时表达量上升,推测表达量上升可能与幼鱼性腺分化相关。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
柳学周 徐永江 廖梅杰 潘传燕 王妍妍
采用RACE技术,在圆斑星鲽(Verasper variegatus)脑中克隆到3种GnRH基因的cDNA序列:cGnRH-Ⅱ、sGnRH和sbGnRH。每种GnRH都包括1个信号肽、1个Gly-Lys-Arg连接序列和1个GnRH相关肽。其中,cGnRH-Ⅱ的cDNA全长为568 bp,编码85个氨基酸,ORF为255 bp,5′UTR为141 bp,3′UTR为169 bp。sGnRH的cDNA全长为457 bp,编码90个氨基酸,ORF为270 bp,5′UTR为41 bp,3′UTR为143 bp。sbGnRH的cDNA全长为381 bp,编码98个氨基酸,ORF为294 bp,5′U...
关键词：
圆斑星鲽 GnRH 分子克隆 表达特性
[期刊] 水产学报
[作者]
郑风荣 郭湘云 刘洪展 李青 王波
为了研究星斑川鲽ＭＨＣⅡ类分子的作用及调控机制，实验通过ＳＭＡＲＴ－ＲＡＣＥ技术克隆得到了星斑川鲽ＭＨＣⅡ恒定链（ＭＨＣⅡＩＩ）的全长ＣＤＮＡ序列，其长度为１７６６ ｂｐ，包含１３５ ｂｐ的５′非编码区、８３７ ｂｐ的开放阅读框和７９４ ｂｐ的３′非编码区。该基因共编码２７９个氨基酸。理论分子量为３０．８４８ ｋｕ，等电点为６．８９。与已知物种ＭＨＣⅡＩＩ进行同源性比对，结果与狼鲈、紫红笛鲷和鳜关系较近，同源性均为７９％。利用ｑｕＡＮＴＩＴＡＴＩｖＥ ＲＥＡｌＴＩＭＥ ｐＣＲ（ｑＲＴ－ｐＣＲ）技术检测了ＭＨＣⅡＩＩ在星斑川鲽不同组织中的表达，以及爱德华氏菌感染前后对该基因在不同组织中表达水平的．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李宏俊 王娟 高祥刚 苏浩 刑坤 傅立元 赫崇波
通过表达序列标签法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,分离和克隆了圆斑星鲽(Verasper variegatus)主要组织相容性复合体(MHC)IIB的全长cDNA序列,该cDNA全长为1144bp,5'UTR(untranslated region)为7bp,3'UTR为450bp,开放阅读框(ORF)长度为687bp,可编码228个氨基酸,包含信号肽、抗原结合域(β1)、IGC区(β2)、跨膜区和胞质区5个结构域。同源分析表明,圆斑星鲽MHCIIB氨基酸序列与其他硬骨鱼具有49%～79%的同源性,与鼠、人、红原鸡和护士鲨的相似性较低,分别为34%、33%、31%和30%。圆斑星鲽MH...
[期刊] 水产学报
[作者]
臧坤 柳学周 徐永江 张凯 史宝 史学营 李存玉
利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得星突江鲽生长激素基因(GH)的cDNA序列全长为957 bp,其中开放阅读框(ORF)长615 bp,编码204个氨基酸,氨基酸序列与牙鲆同源性最高达到73.0%,系统进化显示,星突江鲽GH与其他鲽形目和鲈形目鱼类聚为一个分支。采用实时荧光定量PCR技术对GH基因的组织表达特性进行了分析,结果显示,GH基因mRNA主要在雌雄成鱼垂体中表达,同时在脑、性腺、肝脏、胃和肌肉中均检测到表达,雌鱼胃和肌肉中GH基因mRNA的表达量显著高于雄鱼(P<0.05),表明星突江鲽GH可能主要通过旁分泌和自分泌方式参与性别二态性生长调节。本实验成功构建了体外重组表达质...
[期刊] 水产学报
[作者]
金国雄 温海深 柳学周 何峰 李吉方 陈彩芳 史宝 张葭人 陈晓燕 史丹 杨艳平
细胞色素P450芳香化酶(P450arom)作为P450细胞色素酶超家族中的一员,是性类固醇生成途径中的末端酶,能够将雄激素转化为雌激素。在大多数脊椎动物中,P450arom由CYP19单基因编码。但是在鱼类中存在两种P450芳香化酶,分为性腺型芳香化酶(P450aromA)和脑型芳香化酶(P450aromB),它们由不同的基因(CYP19a和CYP19b)编码,分布在不同的组织。通过简并引物扩增及RACE cDNA扩增克隆,在国内外首次获得全长为2167bp的条斑星鲽CYP19a cDNA序列,并将推测的氨基酸序列与其它物种P450arom氨基酸序列进行多重比较,发现存在跨膜螺旋区、I-螺旋...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈蓉 常国斌 张颖 陈国宏 胡国顺 栾德琴 刘艳 戴爱琴
【目的】目前,国内外尚无有关禽类piRNAs及其结合蛋白Piwi的研究报道,开展禽类小分子RNA及其结合蛋白的研究将为小分子RNA的遗传特性、发生和消失机理以及转基因鸡等研究提供基础依据。【方法】以鹌鹑为研究对象,通过构建cDNA文库和TA克隆测序的方法从睾丸组织中获得piRNAs序列和Piwil1基因的CDS序列,同时采用Q-PCR技术分析了鹌鹑不同生命阶段不同组织中piRNAs和Piwil1基因的表达规律。【结果】从鹌鹑睾丸组织中克隆了13个piRNAs序列和Piwil1基因的CDS序列;Q-PCR结果表明piRNAs和Piwil1基因在鹌鹑不同生命阶段不同组织中均有不同程度地表达。【结论...
关键词：
鹌鹑 睾丸 piRNAs Piwi 克隆
[期刊] 淡水渔业
[作者]
李创举 杨晓鸽 岳华梅 叶欢 危起伟
Ｐｉｗｉ是鱼类配子发生和性腺发育的重要调控因子。本研究从中华鲟（ＡｃｉＰｅｎｓｅｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）性腺中克隆得到了Ｐｉｗｉ基因的全长ｃ ＤｎＡ序列，该序列长３ ３９３ ｂＰ，开放阅读框为２ ５８３ ｂＰ，编码８６０个氨基酸。氨基酸序列多重对比发现，该序列具有ＰＡＺ和Ｐｉｗｉ保守结构域，与其他鱼类Ｐｉｗｉｌ具有较高同源性；系统进化分析显示，中华鲟Ｐｉｗｉｌ聚于Ｐｉｗｉｌ１分支；因此，所得序列为Ｐｉｗｉ－ｌｉｋｅ １基因，命名为ＡｓＰｉｗｉｌ１。荧光定量Ｐｃｒ研究表明，ＡｓＰｉｗｉｌ１为母源表达，且其表达量随着胚胎发育逐渐降低；ＡｓＰｉｗｉｌ１在性腺中大量表达，在脑组织中也有较低水平的表达。性．．．
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王杉 徐文腾 李明 王洁 王磊 翟介明 陈松林
虹彩病毒是造成斑石鲷(Oplegnathus punctatus)工厂化养殖中大规模死亡的主要病原,其感染力极强,感染后的斑石鲷死亡率高,严重影响了斑石鲷养殖产业发展。转化生长因子TGF-β1是一种重要的免疫调节因子,在病毒免疫应答中发挥重要作用。为研究TGF-β1在斑石鲷被虹彩病毒感染过程中发挥的作用,运用RACE和实时荧光定量qRT-PCR技术对TGF-β1进行了基因克隆,并对其进行在不同组织、不同时间点相对表达量的差异分析。结果显示,斑石鲷TGF-β1基因c DNA序列全长为3157 bp,5’非编码区长712 bp,3’非编码区长1278 bp,开放性阅读框长1167 bp,编码388个氨基酸,基因组包含6个外显子和5个内含子。同源分析发现,TGF-β1和鱼类相似度较高,与半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的同源性最高,为76.67%。TGF-β1在斑石鲷健康组织(肝脏、脾脏、肾脏、头肾、心脏、鳃、胃、肠和皮肤)中均有表达,在头肾、肠、肝脏和皮肤组织中表达量较高,而在脾脏和肾脏组织表达量较低。为进一步研究TGF-β1在病毒感染过程中相对表达量的变化,对健康斑石鲷注射虹彩病毒进行刺激,随后比较了TGF-β1在脾脏、肝脏、肾脏、头肾4个不同组织、不同时间点的相对表达量的差异,在头肾、脾脏和肝脏中,病毒刺激后TGF-β1的表达量均出现升高,但在脾脏和肝脏中,峰值出现在刺激后第4天,而在头肾中峰值出现在感染后的第10天。在肾脏中,病毒刺激后的TGF-β1的表达呈现下降趋势,0 d表达量最高,4、7 d依次降低,7 d降至最低,10 d有所恢复。以上研究表明,TGF-β1可能响应了虹彩病毒对机体的刺激,可能在对病毒免疫应答中发挥作用。而病毒感染后不同组织中TGF-β1相对表达量的差异,则值得进一步研究。
关键词：
斑石鲷 虹彩病毒 TGF-β1
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙海龙 宋娟 高志红 倪照君 章镇
【目的】从‘大嵌蒂’果梅中克隆PmKNAT2,并对其结构特征及表达模式进行分析,为研究果梅雌蕊败育的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI中查找与果梅相似性很高的桃KNOPE2(KNAT2的同源基因)序列(EF093491),根据桃的KNOPE2序列设计特异引物;采用改良CTAB法提取‘大嵌蒂’果梅花芽总RNA;通过RT-PCR和RACE技术获得基因cDNA序列全长;使用DNAMAN软件进行序列拼接;利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;通过生物信息学方法分析结构特征;用DNAMAN软件分析基因的ORF和氨基酸序列;MEGA4.0软件进行系统进化树的构建;...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭亚格 刘佳隆 齐志颖 何雷 贾艳艳 陈建 陈松彪 廖成水 丁轲 余祖华
【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-T载体,测序后对鸡FGL2基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析。构建原核表达质粒pET-32a-FGL2,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。【结果】成功克隆了鸡FGL2基因的CDS区,序列全长为1 320 bp,编码439个氨基酸。生物信息学分析显示,鸡FGL2氨基酸与火鸡、雉鸡、珍珠鸡、鹌鹑等禽类的同源性高,达96%以上;与哺乳类动物的同源性较低,其中与犬的同源性仅有64.8%。FGL2蛋白由439个氨基酸组成,理论分子质量为50.24 ku,分子式为C_(2 221)H_(3 451)N_(615)O_(673)S_(22),理论等电点(pI)为8.63,为不稳定的亲水性分泌型蛋白,无跨膜区。成功构建了原核表达质粒pET-32a-FGL2,其在大肠杆菌BL21(DE3)可表达以包涵体形式为主的FGL2融合蛋白,分子质量约为70 ku。【结论】成功克隆出了1 320 bp的鸡FGL2基因,明确了其编码蛋白的生物学信息,经诱导表达后获得FGL2重组蛋白。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
董娟娟 王兰梅 宋飞彪 傅建军 朱文彬 董在杰
β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中的关键因子,参与调控性腺发育和分化。本研究首次克隆得到福瑞鲤(Cyprinus carpio)β-catenin2的c DNA全长序列,采用荧光定量PCR技术分析了β-catenin2基因的组织表达模式及注射外源性激素对福瑞鲤β-catenin2基因表达的影响。结果表明,β-catenin2 c DNA全长3 411 bp,编码780个氨基酸,预测分子量为85. 52 ku;实时荧光定量PCR表明,β-catenin2 mRNA在血液中表达量最高,其次是性腺和脾脏;且β-catenin2 mRNA表达量在福瑞鲤性腺发育早期,随着性腺发育的成熟而升高。睾丸甾酮(T)处理后发现:卵巢中β-catenin2 mRNA表达量在10μg/g 24 h处理组显著升高(P 0. 05);以上结果表明,β-catenin2在福瑞鲤性腺发育早期是必需的。
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
栾嘉豫 安琳君 任丽 李慧玉
【目的】通过克隆白桦BpTCP2基因,分析其序列特征,并检测该基因在不同组织部位、激素处理及非生物胁迫下的基因表达特性,为揭示BpTCP2在植物生长发育及逆境应答中的作用提供理论依据。【方法】通过PCR技术克隆BpTCP2基因的全长,并对得到的cDNA序列进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术分析该基因的组织表达特性,以及在外源植物激素(ABA、IAA、BR、JA、SA)处理和非生物胁迫(CdCl_2、NaCl、NaHCO_3、PEG)下的响应模式。【结果】成功克隆了BpTCP2基因的cDNA序列;生物信息学分析发现BpTCP2含有高度保守的bHLH结构域,属于PCF亚类。qRT-PCR结果显示,BpTCP2基因在木质部、幼嫩的叶片和茎节中表达量较高;在CdCl_2、NaCl、NaHCO_3处理下,该基因持续上调表达;且5种外源激素均能诱导该基因表达。【结论】BpTCP2基因参与白桦木质部的形成,影响叶片及初期茎节的发育,并能在各激素、重金属、盐、碱的诱导下表达。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
甄军波 刘琳琳 杜海英 刘迪 蔡肖 张建宏 迟吉娜
【目的】甘油-3磷酸酰基转移酶(GPAT)是植物三酰甘油合成途径的3个关键酶之一,在油脂品质改良和生物质能源利用方面具有重要的应用价值。【方法】本研究通过同源克隆技术,从多年连续自交的海岛棉材料海资8号中获得了海岛棉甘油-3磷酸酰基转移酶基因,命名为GbGPAT2。【结果】GbGPAT2基因cDNA全长1294 bp,包含1个1113 bp的开放阅读框,编码1条370个氨基酸组成的多肽,预测分子量为42.4 kD,等电点为8.72。该基因编码的蛋白具有2个保守结构域,即典型的溶血磷脂酰基转移酶相似家族保守区(LPLAT-LPCAT1-like,Lysophospholipid Acyltransferases-Lysophospholipid Acyltransferases like)和酰基转移酶超家族保守结构域(NAT-SF, N-Acyltransferase superfamily)。GbGPAT2与小桐子、杨树、大豆和拟南芥的GPATs氨基酸同源性在91.2%～85.4%。跨膜区分析表明,GbGPAT2有2个跨膜结构域,亚细胞定位试验表明,GbGPAT2定位于细胞质膜上。qRT-PCR分析表明,GbGPAT2在胚发育的不同时期表达丰度不同,在开花后25 d的胚中表达量最大。【结论】推测GbGPAT2在海岛棉种子油脂合成中起重要作用。
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