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[期刊] 中国农业科学  [作者] 李文文  卢政  谭勋  李君君  
【目的】围产期奶牛对细菌性疾病的易感性升高。本研究的目的在于探讨Nod-2受体在围产期奶牛中性粒细胞(PMN)中的表达变化及其对PMN细胞呼吸爆发功能的影响,以揭示Nod-2在围产期奶牛免疫机能改变中的作用。【方法】采用RT-PCR法检测围产期和非围产期泌乳奶牛外周PMN细胞中Nod-2 mRNA的表达变化;全血分别用佛波醇酯(PMA)和Nod-2受体特异性配体胞壁酰基二肽MDP刺激,采用流式细胞仪检测PMN呼吸爆发功能。【结果】围产期奶牛PMN细胞Nod-2 mRNA表达量显著低于非围产期奶牛(P<0.05);受PMA刺激后,围产期奶牛PMN呼吸爆发功能显著低于非围产期奶牛(P<0.05);...
[期刊] 华北农学报  [作者] 秦彤  王皓宇  郝海生  王栋  杜卫华  朱化彬  
选择合适的内参基因是利用实时荧光定量PCR准确分析基因相对表达量的先决条件。选择了奶牛乳腺研究中广泛使用的7个候选内参基因,包括GAPDH、ACTB、18S rRNA、RPS9、RPS15、UXT、MYC。奶牛以精粗比不同的2种日粮饲喂,并在产后16 d采集乳腺组织。利用qRT-PCR技术探讨了候选内参基因在围产奶牛乳腺组织中的表达情况,并利用geNorm程序对数据进行分析。结果发现,UXT和RPS9表达稳定,不受日粮精粗比的影响,因此,可作为围产期奶牛乳腺组织基因表达分析中相对合适的内参基因。
[期刊] 华中农业大学学报  [作者] 郗明君  刘立春  张涓  汤孝成  刘小玲  林蠡  
采用51%Percoll非连续密度梯度离心法分离团头鲂头肾吞噬细胞,在光镜和电镜下观察所分离细胞的显微、超微结构及吞噬作用;以二氢罗丹明(DHR123)为荧光探针,流式细胞仪检测细胞在佛波豆蔻酸乙酯(PMA)刺激下产生的呼吸爆发活动;光镜下观察壳聚糖对吞噬细胞吞噬功能的影响。结果表明:分离得到的细胞具有吞噬细胞(巨噬细胞与中性粒细胞)的形态学及功能特征;3种壳聚糖组(100μg/mL)均能提高吞噬细胞的呼吸爆发功能,在发荧光细胞比例及细胞发荧光强度上均极显著高于对照组。其中水溶性壳聚糖组的发荧光细胞比例显著高于其他试验组,而在细胞发荧光强度上,普通壳聚糖作用相对较高;同时壳寡糖能增强吞噬细胞的...
[期刊] 中国农业科学  [作者] 徐丹丹  王建发  张旭  刘东宇  许小楠  王乐  陈嘉  单旭菲  王晓雅  武瑞  杨彬  
【目的】奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最为常见,同时也是带来经济损失最为严重的疾病之一,其主要病因是细菌感染。奶牛乳腺的固有免疫是抵抗病原菌入侵的第一道防线。NOD2是机体固有免疫模式识别受体核苷酸结合寡聚域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)蛋白家族中的重要一员,通过识别其特异性配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)——一种广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中的成分,而参与抵抗多种病原菌入侵。奶牛乳腺上皮细胞(bovine
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)  [作者] 张乐颖  王加启  杨永新  卜登攀  李珊珊  魏宏阳  
采用蛋白质组学方法,检测了产前注射维生素AD3E(V-AD3E)对围产期奶牛乳蛋白表达的影响.二维凝胶电泳分离了产后第1天和第21天乳蛋白组分,凝胶经染色、酶切、图像采集和斑点比对,与对照(不注射V-AD3E)组第1天乳蛋白图谱相比,注射组第1天乳蛋白图谱上有5个区域的蛋白表达上调,经高效液相色谱串联离子阱质谱对差异表达蛋白进行鉴定,主要为免疫球蛋白G(IgG)和白蛋白.产前注射V-AD3E上调了初乳中的IgG和白蛋白,不仅为饲喂初乳的犊牛提供了更好的免疫保护,而且提高了处于免疫抑制阶段母牛的抗病力.
[期刊] 中国农业科学  [作者] 毕崇亮  刘俊俊  王亨  王娟  韩照清  关立增  
【目的】硒(Se)能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究。因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌(S. aureus)感染的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。【方法】首先将bMECs以106细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80%的汇合度时,用含2、4和8μmol·L~(-1)浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12 h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S. aureus按MOI=1:1的比例加入6孔板中,继续培养0.5 h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测。本试验共分3大组,即对照(Con)组(bMECs)、模型(Mod)组(bMECs+S. aureus)和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组(bMECs+2μmol·L~(-1) Se+S. aureus)、Mid组(bMECs+4μmol·L~(-1) Se+S. aureus)和Hig组(bMECs+8μmol·L~(-1) Se+S. aureus),每组设3个重复。利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取。应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平。将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜,回收一抗。之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2 h,回收二抗。PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影。【结果】S. aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里添加2μmol·L~(-1)的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L~(-1)的硒可显著抑制Nod2的表达(P<0.05),而在培养基里添加8μmol·L~(-1)硒可显著抑制RIP2蛋白的表达(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L~(-1)的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.05),在培养基里添加8μmol·L~(-1)的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L~(-1)硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L~(-1)硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里分别添加4μmol·L~(-1)和8μmol·L~(-1)硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平(P
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)  [作者] 江中良  胡建宏  史怀平  王立强  李青旺  
【目的】研究体外培养牛卵巢颗粒细胞中Sprouty基因(Spry)的表达,探讨成纤维细胞生长因子1(FGF1)对Spry基因表达的影响。【方法】从屠宰场收集牛卵巢,剪下直径2~5 mm的卵泡,机械破碎卵泡后收集颗粒细胞进行体外培养,在培养的第5天用FGF1和PD98059处理培养的颗粒细胞,然后用Trizol提取细胞总RNA,利用牛特异性引物进行实时定量PCR检测,用ΔΔCt方法计算Spry基因的相对表达量。【结果】牛卵巢颗粒细胞可以表达Spry基因;Spry基因的表达与FGF1呈现剂量依赖关系,Spry2和Spry4的表达量随FGF1作用时间的延长呈现出先上升后下降的变化趋势;FGF1信号通...
[期刊] 华中农业大学学报  [作者] 刘小玲  葛海燕  田珍  顾泽茂  雷曼红  
用Percoll连续密度梯度离心法分离黄颡鱼头肾巨噬细胞,经含0.1%牛血清的L-15培养液中培养,在光镜和电镜下观察其形态、超微结构和吞噬作用;采用硝基四氮唑蓝(NBT)与多孔酶标仪检测细胞在佛波豆蔻酸乙酯(PMA)刺激下产生的呼吸爆发,并观察外源皮质醇对黄颡鱼体内外头肾巨噬细胞呼吸爆发活动的影响。结果表明:每尾黄颡鱼可分离出1.2~1.6 mL浓度为1×107cells/mL的高纯度头肾巨噬细胞;培养3~18 h后,贴壁纯化的头肾巨噬细胞达到95%~98%;分离培养的头肾巨噬细胞具有巨噬细胞的形态结构特征,对福尔马林灭活的金黄色葡萄球菌(F-SA)的吞噬率达95%以上。PMA刺激分离的头肾...
[期刊] 华中农业大学学报  [作者] 张李文   陈慧君   王超   张绍波   王盛琪   张博   敖英男   齐智利  
为确定酵母铬和二氢吡啶是否能缓解围产期奶牛热应激,将24头体质量和胎次相近的围产期荷斯坦奶牛随机分为3组,饲养于环境温湿指数(THI)高于68的热应激条件下,对照组饲喂基础日粮,酵母铬组和二氢吡啶组饲喂基础日粮的同时饲喂8 g/(头·d)铬含量为1‰的酵母铬和3 g/(头·d)的二氢吡啶,试验周期为40d,观测酵母铬和二氢吡啶对围产期奶牛热应激反应的影响。结果显示:(1)酵母铬组和二氢吡啶组奶牛与对照组奶牛在呼吸频率上无显著差异(P>0.05)。(2)各组奶牛血清中血糖和胆固醇含量在产前第7天与产后第3天均无显著差异。二氢吡啶组奶牛产前第7天血清中甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。(3)与对照组比较,酵母铬组和二氢吡啶组产前、产后血清中Na+、K+、Cl-的浓度均无显著差异(P>0.05),各组在产前、产后血清中碱性磷酸酶和肌酸激酶的含量也均未出现显著变化(P>0.05)。(4)酵母铬组、二氢吡啶组与对照组奶牛血清中热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)mRNA表达量没有明显差异(P>0.05)。以上结果表明,热应激条件下,在围产期奶牛日粮中添加8 g/(头·d)铬含量为1‰的酵母铬和3 g/(头·d)二氢吡啶对血液生化指标和HSP70 mRNA表达量均无显著影响,说明日粮中添加8 g/(头·d)铬含量为1‰的酵母铬和3 g/(头·d)二氢吡啶对缓解围产期荷斯坦奶牛热应激无明显效果。
[期刊] 中国农业科学  [作者] 武建明  王长法  何洪彬  胡桂学  杨宏军  杨少华  高运东  仲跻峰  
【目的】实现荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组BNBD12的抗菌活性。【方法】RT-PCR扩增荷斯坦牛中性粒细胞BNBD12基因,序列分析后人工合成了适于在大肠杆菌中表达的BNBD12成熟肽,构建原核表达载体pET32a(+)/BNBD12,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过琼脂扩散法分别确定重组蛋白对牛源乳腺炎主要致病菌革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌效果,应用扫描电镜观察重组蛋白的杀菌效应。【结果】测序结果表明扩增片段长度为180bp,可编码含60个氨基酸的成熟蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析显示人工合成的BN...
[期刊] 中国农业科学  [作者] 姜代勋  陈武  谷金妮  许剑琴  于同泉  路苹  穆祥  
【目的】通过对猪中性粒细胞磷酸二酯酶(PDE)基因表达、活性及特异性抑制剂实验检测,研究其存在的主要PDE亚型及在体外的活性,为探讨PDE在中性粒细胞的分布、活性变化及对cAMP、cGMP调节与中性粒细胞功能关系提供依据。【方法】采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PDE基因在猪中性粒细胞的表达,以高效液相色谱(HPLC)检测环核苷酸在PDE反应前后的含量变化,计算PDE活性。【结果】在检测的18个PDE亚型中,PDE1B、2A、3A、3B、4A、4B、4C、4D、5A、7A、7B、8A、8B、9A、11A共15个PDEmRNA在猪中性粒细胞表达,特异性抑制剂实验表明PDE4、PDE5分...
[期刊] 华北农学报  [作者] 李文佼  杜晨光  菅瑞珍  温世勇  王伟平  孙博  徐晓静  刘永志  
为了观察不同剂量食欲素A在不同时间对绵羊黄体化颗粒细胞OX1R表达的影响,在绵羊黄体化颗粒细胞中添加不同剂量(0.05,0.2,0.5,1μg/mL)食欲素A,分别于刺激后0,2,6,12 h提取细胞总RNA,运用RT-qPCR方法检测了OX1R mRNA相对表达量变化。结果表明,OX1R mRNA分布于绵羊黄体化颗粒细胞中;添加高剂量(1μg/mL)食欲素A在2 h显著性促进OX1R mRNA表达(P
[期刊] 中国农业科学  [作者] 李鹏飞  毕锡麟  王锴  景炅婕  吕丽华  
【目的】探讨牛卵泡颗粒细胞中可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript,cart)的表达对牛不同阶段卵泡发育的影响。【方法】通过对牛卵泡转录组odF1(the largest onset oF deviation Follicle)和odF2(the second largest onset oF deviation Follicle)颗粒细胞(granulesa cells,gcs)构建rna文库,illumina hi seq 2000平台测序;采集屠宰牛双侧卵巢,通过黄体形态特征筛选处于第一卵泡波阶段的最大卵泡和第二...
[期刊] 中国农业科学  [作者] 朱家桥  曹随忠  熊桂林  顾建红  汪纪仓  刘宗平  
目的探讨硫辛酸对围产期奶牛血清脂肪代谢和肝功能酶的影响。方法选择产前约20d的干乳期奶牛48头,分为4组,Ⅰ组为对照组,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别每头补饲硫辛酸3、5、8g·d-1,连续50d,检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(Chol)、非酯化脂肪酸(NEFA)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量及血清碱性磷酸酶(AKP)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性。结果第Ⅲ、Ⅳ组血清NEFA含量第20天后低于对照组,第Ⅳ组第30天显著低于对照组(P<0.05);试验组血清AST活性第30天后均显著(P<0.05...
[期刊] 中国农业科学  [作者] 杜金梁  秦建华  褚景生  徐丽娜  马玉忠  
【目的】探讨复方益母生化散对奶牛子宫内膜炎的作用机理。【方法】体外实验:分离奶牛子宫内膜细胞,细菌脂多糖(LPS)诱导子宫内膜细胞炎症模型,复方益母生化散处理子宫内膜炎症细胞48h、72h,Western blotting法检测CYP450的表达;体内实验:复方益母生化散栓剂治疗患有子宫内膜炎的奶牛,检测血清中IgG、IgA含量的变化。【结果】复方益母生化散处理后,子宫内膜炎症细胞CYP450的表达随复方益母生化散剂量的增加而呈升高的趋势,血清中IgG、IgA的含量与对照组相比明显升高。【结论】2000μg·mL-1的复方益母生化散作用奶牛子宫内膜炎症细胞48h,CYP450的表达最明显。
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