Phage display antibody library has been proven to be a powerful technique used in development of antibodies. Since it was established in 1990, the technology has made enormous improvement and played more and more important role in basic research of biology, immunology, oncology, protein engineering,...

随着水产养殖业的发展,养殖密度越来越高,细菌性疾病暴发频繁。现如今主流抗菌手段是抗生素,但其大规模且不规范的使用使得细菌耐药性问题越发严重。为了有效防治水产细菌性疾病,加快推进水产养殖业绿色发展,促进产业转型升级,人们亟需寻求新的抗菌手段来缓解当今的局面。噬菌体是一种感染细菌和古细菌的病毒,具有专一性强、不易产生抗性、代谢快、易开发及成本低等优点。在国内外被广泛研究,同时也被应用于多种疾病的防控,其相关产品也获得认可,但其本身存在的限制也不容忽视。本文首先综合介绍了噬菌体治疗的原理和优势,然后对噬菌体治疗在水产养殖动物细菌性疾病中的研究进展进行综述,并对噬菌体治疗现存的困难和应对策略进行讨论,最后在此基础上作出展望,期望能够为后续噬菌体在水产上的应用研究提供参考。

本研究以兽药恩诺沙星为对象,构建噬菌体抗体库,为低成本、快速制备目的抗体提供新的途径。以恩诺沙星-鸡卵清蛋白(ENR-OVA)为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫,取其脾细胞提取总RNA,并分别扩增全套抗体轻、重链基因,通过重叠延伸PCR技术,以编码柔性多肽(Gly3Ser)4的基因为接头,将轻重链基因组装为完整的scFv基因,将之克隆入pCANTAB5E载体,转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13KO7对其进行超感染,构建噬菌体抗体库并进行富集、筛选和鉴定;构建了库容量约为2.2×106的抗恩诺沙星噬菌体单链抗体库,并筛选出26株阳性克隆,为表达单链抗体、建立免疫检测方法奠定基础。

本文综述了噬菌体展示技术的研究现状和发展趋势 ,着重描述了噬菌体展示技术的筛选方法及其在生命科学研究领域的广泛应用 ,结合目前我国天牛防治存在的问题 ,分析了噬菌体展示技术在天牛防治技术研究中的应用潜力

【目的】构建单链抗体(ScFv)噬菌体表面展示文库,从中筛选抗羊抑制素单抗并进行表达,建立制备羊抑制素单抗的新方法。【方法】用未经免疫的多种小鼠脾细胞作为基因来源,采用噬菌体抗体库技术,构建天然噬菌体表面抗体文库。用羊抑制素对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗羊抑制素单抗,用ELISA检测其抗原结合活性。【结果】构建了天然鼠源噬菌体抗体库,为筛选和制备各种单链抗体提供了一个平台。用羊抑制素对其进行筛选,制备抗羊抑制素单抗,经ELISA检测,55/96克隆具有与羊抑制素结合活性,阳性率为57%。【结论】制备的羊抑制素可溶性ScFv及其表面展示噬菌体抗体有很好的抗原结合活性,为羊抑制素单抗的制备提...

用猪脂肪细胞以免疫删减法免疫小鼠,取其脾细胞,RT-PCR扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E中,构建单链抗体(ScFv)文库。用猪脂肪细胞,对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗猪脂肪细胞膜单抗。经ELISA检测,51/96克隆具有与猪脂肪细胞结合活性,阳性率为53%,与猪肝细胞则成阴性反应,初步证明了单抗的特异性,为猪脂肪细胞膜单抗的制备提供了一种新的方法。

从伏马菌素B1(FB1)杂交瘤细胞株F3中扩增出V H和V L基因片段,再经重叠延伸PCR(SOE-PCR)拼接扩增得到单链抗体(ScFv)基因,然后克隆到pCANTAB 5E噬菌粒载体上,转化感受态大肠杆菌TG1,并经辅助噬菌体M13K07超感染,构建FB1毒素噬菌体单链抗体库,ScFv基因插入率为100%,库容约为1.5×107,噬菌体的滴度为2.1×1015PFU·mL-1。免疫亲和筛选和富集后,经ELISA法最终筛选得到5株可分泌阳性噬菌体抗体的细菌。结论:伏马菌素B1噬菌体单链抗体库构建成功。

【目的】笔者实验室前期免疫并构建噬菌体展示纳米抗体库,应用此抗体库筛选、制备可以用作黄曲霉毒素无毒替代抗原的纳米抗体。本研究旨在探明已筛选出的噬菌体展示纳米抗体Phage 2-5用作黄曲霉毒素替代抗原的活性,为后续纳米抗体的合成以及黄曲霉毒素绿色免疫分析方法的建立奠定基础。【方法】前期,笔者实验室对羊驼免疫黄曲霉毒素抗原(AFB1-BSA),经过5次免疫后,取血,提取RNA,反转录为cDNA,并采用PCR技术对抗体可变区VHH区域进行扩增,与载体pComb3X偶联,构建噬菌体展示纳米抗体库;经过吸附-洗脱的淘选过程筛选出能够与黄曲霉毒素竞争结合抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11的噬菌体展示纳米抗体...

利用猪传染性胸膜肺炎灭活菌苗免疫日本大耳兔得到猪传染性胸膜肺炎抗血清,将血清用饱和硫酸铵粗提IgG后,经DEAE-sephadex-A50低压层析系统纯化,以此得到IgG作为配基包被酶标板,对噬菌体随机十二肽库进行3轮不同条件的富集筛选,通过改变筛选条件,噬菌体的回收率从5.76×10-5增加到了1.69×10-2,P/N值逐步提高;随机挑取10个噬菌斑进行扩增,用ELISA检测其免疫活性,结果有6个阳性克隆与纯化的IgG有较强的特异性结合能力;对筛选到的6个阳性克隆提取ssDNA进行测序,并分析其氨基酸序列,其中5个克隆所递呈的序列一致,用Blastp软件进行分析,2种类型的氨基酸序列之间无...

为筛选牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）gP48蛋白的单链抗体，本研究利用噬菌体展示技术构建了gP48蛋白单链抗体克隆文库，通过微孔筛选法对抗体库进行3轮富集淘筛，利用ELISA技术测定单链抗体的亲和力，对亲和力较高的克隆进行基因测序分析和结合活性测定，旨在获得gP48蛋白的单链抗体。结果表明：1）成功构建了库容量为4.3×107的噬菌体单链抗体库，其重组率为83.3%，经三轮筛选对噬菌体抗体库进行富集，富集倍数为1.43×104;2）优化了间接ELISA方法，筛选到3株与BVDV gP48蛋白具有高亲和力的单链抗体以及其基因序列，通过IgBLAST分析显示，3株单链抗体均为鼠源IgG。综上，从gP48蛋白的单链抗体库中筛选获得3个具有高亲和力的单链抗体，可用于后续BVDV检测方法的建立。

用生长抑素(somatostatin,SS)疫苗“激生1号”免疫日本大耳兔得到抗血清,经饱和硫酸铵粗提IgG,再经DEAE-sephadex-A50低压层析系统纯化后,以此IgG作为筛选配基,对随机十二肽库进行4轮淘洗。随机挑取22个噬菌斑进行双夹心ELISA,结果有6个克隆与SS抗体有较强的特异性结合力,竞争抑制ELISA进一步证明6个克隆有较好的抑制作用。将6个阳性克隆提取ssDNA进行测序,测序结果中有5个克隆的外源肽序列完全一致,经与SS氨基酸序列比对,发现两者有共同序列FWK,说明5个克隆模拟了生长抑素的抗原表位。

　为构建抗人整合素ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面表达,采用PCR方法从整合素ανβ3单抗E10ScFv载体中,扩增重链可变区VH和轻链可变区VL基因。将VH基因与人重链恒定区CH1基因连接,VL基因与人CK基因连接,分别构建了鼠/人嵌合重链FD基因和轻链基因,将其克隆入pComb3,构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,用辅助噬菌体VCSM13超感染,间接ELISA及竞争抑制ELISA检测鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体活性。结果成功构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面展示了可结合人整合素ανβ3抗原的鼠/人嵌合Fab抗体。

【背景】在中国，柑橘黄龙病（citrus Huanglongbing,HLB）是由候选韧皮部杆菌亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas）所引起的一种毁灭性病害，严重威胁着柑橘产业的可持续发展。前期研究表明CLas全基因组上鉴定出3种单独类型的原噬菌体基因序列，而广东黄龙病菌主要以Type-2原噬菌体类型和Type-1+3混合原噬菌体类型为主。这两种CLas菌株在传病媒介——柑橘木虱（Diaphorina citri）体内的增殖及其对寄主植物的致病力差异依然不清楚。【目的】比较Type-2-CLas菌株和Type-1+3-CLas菌株在柑橘木虱体内的增殖能力和对砂糖橘（Citrus reticulata Blanco cv.Shatangju）的致病力差异。【方法】嫁接准备含有不同CLas菌株的砂糖橘，分别将50头柑橘木虱若虫和50头成虫放置到含有不同CLas菌株的砂糖橘嫩梢上刺吸获菌6、12、18 d，利用荧光定量PCR检测并统计柑橘木虱若虫期、成虫期对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas的获菌率和获菌量差异。饲养分别携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的柑橘木虱种群，分别将携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的20头柑橘木虱成虫置于健康砂糖橘嫩梢上刺吸2周，移除木虱后统计柑橘木虱获菌率和获菌量，每月追踪砂糖橘症状变化和叶片病菌浓度，利用光学显微镜观察接种360 d时叶片韧皮部和薄壁细胞形态学变化情况。【结果】柑橘木虱以若虫形态对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的获菌率和获菌量无显著差异，但柑橘木虱以成虫形态对Type-2-CLas的获菌率和获菌量显著高于Type-1+3-CLas菌株。在虫传后120 d时接种Type-2-CLas菌株的叶片附近新叶会呈现更严重的斑驳症状。Type-2-CLas菌株侵染砂糖橘一年后抽出的新叶转绿不正常，出现均匀黄化、小叶的明显症状，而Type-1+3-CLas菌株新叶症状则为典型斑驳和革质化。叶片解剖观察结果发现，在叶片病菌浓度相近的情况下，相比于接种了Type-1+3-CLas的叶片，接种了Type-2-CLas菌株的叶片韧皮部细胞发生更严重的细胞塌缩，在叶脉和叶肉薄壁细胞内造成较多的淀粉粒积累。【结论】Type-2-CLas比Type-1+3-CLas更容易在柑橘木虱成虫体内增殖，且达到较高的病菌浓度，间接证明了Type-2-CLas菌株具有高传染性。感染Type-2-CLas的新叶呈现均匀黄化、叶小的症状，而感染Type-1+3-CLas的新叶呈现较为斑驳和革质化的症状，Type-2-CLas比Type-1+3-CLas造成更严重的叶脉韧皮部塌缩和淀粉粒积累情况，说明Type-2-CLas比Type-1+3-CLas对柑橘具有更强的致病力。

为了解载体介导噬菌体入胞及抗胞内寄生菌的最新研究进展，利用文献综述法检索近年载体介导噬菌体入胞的相关文献，从功能发挥、试验技术及应用前景等方面对可应用于介导噬菌体入胞的载体进行整理讨论。结果表明：1)噬菌体作为一类能够感染和裂解细菌的病毒，其天然存在的抗菌特性使其作为抗生素替代物的研究广泛存在，但其靶向胞内寄生菌的基础研究主要集中在国外，国内鲜有报道。2)与游离噬菌体相比，以无机纳米微粒、脂质体等作为载体介导噬菌体入胞，能够防止噬菌体被宿主免疫系统清除和免受细胞内环境影响。3)脂质体因其作为载体可有效提高噬菌体入胞效率及杀菌效率，现已成为研究最广泛的噬菌体入胞载体之一。因此，本文综述近年来国内外关于载体介导噬菌体入胞及抗胞内寄生菌研究进展，详细阐述不同介导噬菌体入胞的载体特性、入胞机制以及如何提高入胞效率等方面的最新研究，并针对目前存在的问题和发展前景进行展望，以期为更有效地利用载体投递系统高效投递噬菌体解决细胞内细菌感染的实际问题提供参考与理论支撑。

建立快速、准确、简便易行的病害早期快速检测技术,是从事动物疫病防控研究工作者和产业界人士的迫切愿望。自从开辟免疫分析技术以来,越来越多更灵敏、更便捷的免疫分析方法被开发出来,以胶体金免疫层析法为基础建立起来的快速检测试纸,被认为是当前最快捷、高敏感的一种免疫学检测技术。该项技术真正实现了快速简易检测靶目标,并已在畜牧业中得到普及应用,成为当前畜禽病害早期防控的最有效方法之一。本文就该项技术在畜牧兽医领域的研究进展、应用现状、发展前景进行了介绍、分析和讨论,旨在为水产养殖动物病害的早期诊断提供借鉴,以期获得一种适用于水产动物病害的、专用的快速检测新技术和新产品。