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[期刊] 中国水产科学
[作者]
龚霞 陆承平 姚火春
通过水生动物源性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)强毒株J-1株与弱毒株MR-1株抑制差减杂交得到gneJ差减片段,该片段与创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和人源嗜水气单胞菌的UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶基因有较高的同源性。扩增完整的gneJ基因,进行分布检测并将其克隆至质粒pET32a(+),在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中进行异源表达,SDS-PAGE结果显示,重组表达蛋白的分子量约59.7kD,与理论推测值基本相同。酶活性分析表明,该重组蛋白可将UDP-乙酰葡萄糖胺转化为UDP-乙酰半乳糖胺,确证gneJ基因编码蛋白...
[期刊] 水产学报
[作者]
吕艳杰 关建义 杜娟 宁黔冀
为进一步探究KK-42缩短蜕皮周期的分子机制,本研究以日本沼虾幼虾为材料,通过RACE技术克隆了几丁质降解途径中的限速酶NAGase基因全长cDNA序列,定量测定了KK-42处理不同时间对表皮组织中NAGase mRNA相对表达量和酶活力的影响。序列分析结果显示,MnNAGase cDNA全长2536 bp,编码617个氨基酸。同源性分析显示,MnNAGase基因保守性较低,与凡纳滨对虾的相似度最高,仅为68%。系统进化分析显示,日本沼虾、三疣梭子蟹、凡纳滨对虾、中国明对虾聚为一个大类,凡纳滨对虾和中国明
[期刊] 中国农业科学
[作者]
宋慧芳 李应龙 马恩波 张建珍
【目的】β－Ｎ－乙酰氨基葡萄糖苷酶（β－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉＮｉｄａｓｅ，Ｎａｇ）是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。研究旨在利用Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达系统获得高纯度ｌｍＮａｇ１蛋白并对其酶学特性进行分析，探究该酶在飞蝗（ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）生长发育过程中的生物学功能，为飞蝗绿色防控分子靶标研发提供理论与实践依据。【方法】根据ｌｍ Ｎａｇ１的ｃｄＮａ全长序列（ｇｅＮ ＢａＮｋ：ＪＸ８８８７２０．１）设计包含酶切位点Ｂａｍ Ｈ Ⅰ、ＨｉＮｄ Ⅲ和６×Ｈｉｓ标签的引物。采用Ｐｃｒ技术扩增包含开放阅读框的目标片段，双酶切后连接至ＰＦａｓｔ Ｂａｃ～（ｔｍ）－ｄ．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
李婷 练森 李保华 梁文星 王彩霞
为探究苹果树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因VmGluI的序列特征及其在病菌侵染致病过程中的表达,以强致病力菌株LXS080601为材料,利用RT-PCR技术克隆基因c DNA序列,通过生物信息学软件对VmGluI编码蛋白的系统进化关系、理化性质和二级结构进行分析,采用实时荧光定量PCR技术测定VmGluI的表达量。结果显示,苹果树腐烂病菌VmGluI的开放阅读框为1 689 bp(GenBank登录号KY646110),编码562个氨基酸,蛋白分子量62.7 k Da。VmGluI编码的蛋白具有糖基水解酶1家
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陆坚 路卫卫 李伟亮 郭晓敏 杜丽琴 韦宇拓 黄日波
【目的】通过宏基因组技术获取土壤微生物总DNA,运用基因克隆、功能筛选、基因表达等手段挖掘新型β-葡萄糖苷酶,为新型微生物资源的开发利用提供科学依据。【方法】提取高糖土壤宏基因组DNA,构建宏基因组文库;筛选文库并对阳性克隆子亚克隆,获得β-葡萄糖苷酶基因;PCR扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌进行表达;采用镍亲和层析对重组酶纯化,研究其酶学性质。【结果】成功构建约含9.2万个克隆的高糖土壤宏基因组文库,获得一个新型β-葡萄糖苷酶基因unbgl3A。该基因大小为2241 bp,在氨基酸水平上,与Gen Bank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的一致性为73%;该酶最适pH为6.0,最适温度为50℃,对对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)的K_m值为6.45 m M,V_(max)为50μmol/(mg·min)。在15～50℃热处理1 h后仍保留90%以上的酶活力,热稳定性较好,且被多种糖激活。【结论】宏基因组技术是获取新酶有效手段,获得的Unbgl3A具有良好酶学性质,可为进一步挖掘其应用潜力及研究耐热机理奠定基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王海波 李芙蓉 杨金翠 高永 郭俊云
为了探究磷酸葡萄糖变位酶(PGM)在植物蔗糖与淀粉代谢中的重要作用,基于同源序列比对的方法,在小桐子基因组中鉴定到1个细胞质型PGM基因(命名为JccPGM)与1个叶绿体型PGM基因(命名为JcpPGM),利用qRT-PCR方法检测JccPGM与JcpPGM基因在小桐子不同器官与低温条件下的表达特性,同时,构建了pGEX-4T-1-JccPGM与pGEX-4T-1-JcpPGM原核表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达分析。结果表明:两者分别编码582,637 aa的蛋白质。聚类分析表明,小桐子pPGM在其N端包含叶绿体定位信号肽,而cPGM较pPGM多4段肽链序列-~(108)VGVDGS~(113)-、-~(183)SGPE~(186)-、-~(283)GKSNSE~(288)-、-~(470)SLGEVN~(475)-。qRT-PCR表达分析显示,小桐子cPGM与pPGM基因都在叶片中高表达,而在根与种子中表达量较低。通过BL21(DE3)诱导表达,分别得到90.7,97.0 ku的蛋白条带,与理论融合蛋白的分子量一致。综上所述,本研究为开展小桐子cPGM与pPGM基因表达蛋白的功能分析以及其在蔗糖与淀粉积累、逆境应答中的机制研究奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
卢其能 杨清 沈春修
根据茄科植物花色苷生物合成相关基因的资料,设计简并引物,通过RT-PCR的方法从马铃薯(Solanum tuberosumcv.Chieftain)紫色芽的cDNA中克隆到类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因(3GT)的全长cDNA。序列分析表明,这个3GT基因编码的多肽为448个氨基酸残基,在氨基酸水平上与茄科的矮牵牛和茄子的一致性最高,均为76%,多重比较和系统发育分析均表明,该基因为3GT家族中的一个新成员。用半定量RT-PCR进行了表达分析表明,3GT在根、叶和块茎中的表达量远高于茎和花;此外,3GT在Chieftain的红色愈伤组织中表达而在非红色愈伤组织中不表达,可见,3GT的表达与花...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
陈蒙 杨铭慧 刘月 LEE Sanghyeob 刘海峰
为明确药西瓜UDP-糖基转移酶催化葫芦素形成葫芦素配糖体的表达规律,以药西瓜品种"WM9"叶片为供试材料,采用RT-PCR技术克隆药西瓜UDP-糖基转移酶基因,并对编码蛋白进行分析。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR),以ACTIN为内参基因,分析获得的2个药西瓜UDP-糖基转移酶基因在不同组织器官中的表达规律。结果表明:克隆得到2个UDP-糖基转移酶基因,分别为1 546 bp和1 559 bp的cDNA全长序列,命名为UDP-E1和UDP-E2。对扩增获得的序列进行生物学信息分析,确定UDP-E1基因的完整开放阅读框(ORF)为1 314 bp,可编码氨基酸437个,理论分子量为49.02 ku,等电点为5.99,属稳定蛋白,Genbank登录号MK576125。UDP-E2基因的ORF为846 bp,可编码氨基酸281个,理论分子量为32.78 ku,等电点为5.23,属不稳定蛋白,Genbank登录号MK576126。这2个基因属于糖基转移酶超家族。UDP-E1和UDP-E2均与香瓜、黄瓜的UDP-糖基转移酶基因序列相似性最高。在各组织器官中,UDP-糖基转移酶均有表达,且在茎中表达水平最低,叶中表达水平最高。
[期刊] 华北农学报
[作者]
冯睿杰 侯丽霞 郭扬 马倩 刘新
为了研究葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因家族的特性,以抗低温品种左优红组培苗为材料,通过同源克隆技术,获得VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4全长CDS,对其序列进行了生物信息学分析,同时利用实时定量PCR技术探究了3个基因的组织表达特性和响应逆境因子及相关信号分子的特性。结果显示:3个基因c DNA大小分别为954,978,1 011 bp,分别编码317,325,336个氨基酸序列;3个蛋白分子量分别为36.65,36.97,38.12 k Da;等电点分别为5.12,5.33和5.16,且均在C
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
陈蒙 刘海峰
为探究5GT基因在山葡萄花色苷合成过程中的表达规律及作用,以山葡萄(Vitis amurensis)为材料,利用RT-PCR技术克隆山葡萄5GT基因的全长cDNA序列(GenBank登录号为GU237133),将该基因命名为Vam5GT并对该蛋白进行生物信息学分析预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测Vam5GT基因在山葡萄8个不同转色时期的表达规律,将克隆获得的Vam5GT基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli Bl2(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物。并构建表达载体pC5GT并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化。结果显示:克隆获得的Vam5GT cDNA全长1 497 bp,开放阅读框1 347 bp,编码448个氨基酸,该基因表达产物相对分子质量为49.84 ku,等电点为5.23,是不稳定蛋白。该基因属于UDPGT超基因家族,不包含信号肽。Vam5GT在山葡萄花后4周的果皮中表达丰度最高,其他时期表达逐渐下降;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,在含50 mg/L Kanomycin的培养基上对拟南芥T_0代种子进行筛选,先后得到2个阳性幼苗,转化率为0.05%。对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
危蓉萍 杨东航 卜莹莹 纪燕玲 于汉寿
［目的］通过表达载体ｐ ＥＴ－２８ａ（＋）在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体ＳｐｉｒｏｐｌａＳｍａ ｍＥｌｌｉｆＥｒｕｍ ＣＨ－１中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶（ＣＨｉＴｉｎ ｄＥａＣＥＴｙｌａＳＥ，Ｃｄａ）基因ＣＨｉｄ，并测定其部分酶学性质，为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。［方法］利用ｏｖＥｒｌａｐ ＥｘＴＥｎＳｉｏｎ ｐＣｒ（ｏＥ－ｐＣｒ）定点突变技术，在引物设计时插入目的突变，通过３次ｐＣｒ获得突变后的目的片段，测序验证后构建重组质粒ｐ ＥＴＣＨｉｄ，挑取ＢｌＣＨｉｄ表达菌株。ｉｐＴＧ诱导表达目的蛋白，ｎＴａ－ｎｉ２＋柱纯化，ＷＥＳＴＥｒｎ ＢｌｏＴＴｉｎＧ验证，紫．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张欢欢 张学尧 刘晓健 马恩波 张建珍
【目的】研究飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶(glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase,GNA)的特性及生物学功能,为探讨飞蝗表皮几丁质的合成机制及研发新型绿色环保杀虫剂提供实验依据。【方法】采用生物信息学方法,在飞蝗EST数据库中搜索GNA的cDNA序列,并与其它物种GNA序列进行同源比较;设计飞蝗GNA特异性表达引物,分析5龄第2天不同组织样品间的表达差异及5龄第1天至第7天表皮中GNA表达量的变化;构建pET-28a(+)蛋白表达载体,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株中表达GNA重组蛋白,Ni柱亲和纯化重组蛋白并分析重组蛋...
[期刊] 水产学报
[作者]
王俊丽 闫潇 卢荣华 秦超彬 梁丽娜 刘燕琴 聂国兴
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
魏跃 陈啸寅 李振陆 王永平 史建磊 吴志明 张蜀宁 陈劲枫
以黄瓜品种露丰为材料,根据已报道的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6PGDH)的保守氨基酸序列设计简并引物,利用RT-PCR技术获得黄瓜6PGDH的cDNA同源片段,命名为CSPG(登录号为EU815934)。该片段长度为1 207 bp,包含一个936 bp的开放阅读框(编码311个氨基酸)和271 bp的Poly A 3′非翻译区末端,无内含子;该基因编码的氨基酸序列与拟南芥、大豆、水稻、玉米、菠菜的6PGDH基因有75%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对6PGDH基因的转录水平进行分析,结果表明:该基因在叶、根、茎中均有表达,高温胁迫下的表达量高于常温对照,说明6PGDH基因与热胁迫...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张聪 郑雪莲 蒲志刚 吴洁 王大一 阎文昭
ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化ADP-葡萄糖合成反应,是淀粉生物合成的限速酶之一。从高淀粉甘薯品种川薯34总RNA逆转录的cDNA中克隆了AGPa1和AGPa2两个α亚基编码序列,进行生物信息学分析后,插入植物高效表达载体pCamb ia1301构建了pC-AGPa1和pC-AGPa2两个双元表达载体,并导入根癌农杆菌EHA105中。获得的工程菌菌株可用于遗传转化甘薯、马铃薯和木薯等重要的薯类作物,为薯类作物高淀粉育种奠定了基础。
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