以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)J-1株基因组为模板,根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物,扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a(+)中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明,插入片段长度为948bp,与NCBI上登录的几个相关序列相比,同源性在93.1%~95%之间,缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21(DE3),经诱导可表达分子量约57.4kD的蛋白,凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50%以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清...

将嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ，Ａｈ）Ｊ－１菌株第５代［Ｊ－１（５）］在产毒素培养基上连续传代至第３５代［Ｊ－１（３５）］，并分别检测Ｊ－１（６）和Ｊ－１（３５）的生化特性。另取Ｊ－１（６）、Ｊ－１（１５）、Ｊ－１（２５）和Ｊ－１（３５）分别制备嗜水气单胞菌灭活疫苗，用其分别免疫鲫鱼，之后用Ａｈ强毒攻击；同时用Ｊ－１（６）经腹腔注射或浸泡各免疫组鲫鱼，测其最低免疫剂量。结果显示，从第５代传至３５代，Ａｈ菌株的培养特性和免疫原性没有显著差异；腹腔免疫和浸泡免疫的最低有效剂量分别为１×１０７ｃｆｕ／尾和５×１０７ｃｆｕ／ｍＬ。表明ＡｈＪ－１株可作为理想的疫苗生产株。

【目的】旨在评价嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA2991的免疫学功能，为探索嗜水气单胞菌渔用疫苗候选抗原提供理论依据。【方法】通过生物信息学分析AHA2991氨基酸序列，揭示不同菌株间的亲缘关系；分子克隆构建AHA2991表达菌株并确定最佳诱导条件；包涵体洗涤及SDS-PAGE切胶纯化获得AHA2991并免疫红鲫；Western blotting检测AHA2991红鲫血清的特异性与效价；ELISA模拟AHA2991红鲫血浆与嗜水气单胞菌的体外相互识别作用；酸性、碱性磷酸酶（ACP、AKP）测定与细胞吞噬作用评价AHA2991非特异性免疫功能；组织病理学切片探究AHA2991免疫对红鲫内脏的影响情况。【结果】AHA2991蛋白家族在不同菌株间具有同源性，不同菌株间亲缘关系较近，尤其在气单胞菌间亲缘关系更近；AHA2991的最佳诱导条件为：菌液浓度OD_(600) =1.0，IPTG终浓度0.1 mmol/L，在28 ℃下诱导8 h。红鲫AHA2991抗血清具有良好的特异性，其效价为1:800；体外AHA2991血浆对嗜水气单胞菌具有识别作用，滴度可达1:3 200；ACP、AKP指标及细胞吞噬作用均显示AHA2991激活红鲫非特异性免疫；组织病理学切片表明AHA2991免疫对红鲫内脏结构无影响。【结论】嗜水气单胞菌AHA2991具有良好的免疫原性，有望成为嗜水气单胞菌渔用疫苗的候选抗原成分。

采用鳗鲡源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)外膜蛋白基因二联表达产物免疫日本鳗鲡(Anguilla japonica),检测其对日本鳗鲡免疫功能的影响及其攻毒免疫保护力。将150尾日本鳗鲡平均分为PBS、细菌免疫和外膜蛋白免疫3个组,3组鳗鲡分别以PBS(0.01 mol/L,p H7.4)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌二联灭活苗(5.0×108 CFU/m L)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌外膜蛋白二联表达产物(500μg/m L)腹腔注射0.2 m L。于免疫后14、21和28 d麻醉鳗鲡采血并分离抗凝血。测定3...

在构建鳗鲡病原性嗜水气单胞菌与爱德华氏菌二联外膜蛋白重组表达载体的基础上，采用不同的诱导剂（IPTG）浓度、诱导温度、诱导时间和诱导时菌液浓度对重组表达载体的表达条件进行探讨。结果表明，不同诱导剂（IPTG）浓度、诱导温度、诱导时间和诱导时菌液浓度对该载体的表达无明显影响。在菌液浓度 D600nm=0.8时，采用0.25 mmol/L的 IPTG经16℃诱导培养过夜后表达。表达产物采用KTApurifier-100 蛋白质纯化仪，结合His标签柱亲和层析后获得分子质量87.1 ku的高纯度蛋白。蛋白经透析复性后免疫鳗鲡以初步研究其免疫原性。结果表明，免疫后第28天，重组蛋白不同剂量注射组的...

根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列,设计和合成了一对引物,以嗜水气单胞菌AhJ-1的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段,并克隆到质粒载体pGEM-T中进行测序和分析,结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％,扩增片段编码343个氮基酸,推测的分子量为35700,计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性,可作为核酸疫苗的侯选基因片段。

为评价嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)PDK06株外膜蛋白A(omp A)的原核表达产物是否具有抗原性及其对斑点叉尾(Ictalurus punctatus)的免疫保护力,根据Gen Bank上嗜水气单胞菌外膜蛋白omp A基因序列(Gen Bank登录号:AF146597)设计去信号肽引物,扩增获得一段约1 000 bp的序列,经鉴定正确后,构建重组表达质粒p ET-32a(+)-pomp A;然后将该质粒转入BL21(DE3)后用IPTG诱导表达,经纯化后得到pomp A重组蛋白;最后将pomp Aomp A蛋白与弗氏不完全佐剂(FIA)混合免疫斑点叉尾,评价...

为评价嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)PDK06株外膜蛋白A(ompA)的原核表达产物是否具有抗原性及其对斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的免疫保护力,根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号:AF146597)设计去信号肽引物,扩增获得一段约1000bp的序列,经鉴定正确后,构建重组表达质粒pET-32a(+)-pompA;然后将该质粒转入BL21(DE3)后用IPTG诱导表达,经纯化后得到pompA重组蛋白;最后将pompAompA蛋白与弗氏不完全佐剂(FIA)混合免疫斑点叉尾鮰,评价其免疫效果。结果显...

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势。构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右。重组蛋白纯化后皮下途径免疫小鼠,能够诱导高滴度(105)的IgG,鼻腔内途径免疫小鼠不仅能够诱导高滴度(104)的IgG,还能诱导高达102的IgA。二免后攻击50...

以携带质粒ｐＡＭ１２０（Ａｐｒ、Ｔｃｒ／Ｔｎ９１６）的大肠杆菌ＣＧ１２０株为供体菌，与受体菌嗜水气单胞菌Ｊ－１株，采用滤膜接合法进行接合转移，在选择平板（含Ｔｃ、ｃｆｚ和脱脂奶）上进行筛选，筛选出６株蛋白酶缺失株（ＥＣＰａｓｅ－），ＥＣＰａｓｅ－菌株其生长速度，对正常鲫血清的抗性降低，用脱脂奶平板法及底物法检测，蛋白酶产霞明显降低。与亲本Ｊ－１株相比，突变株致病力降低，对鲫的半数致死量大于１０~８（Ｊ－１株对鲫的半数致死量为５×１０~３）。用ＥＣＰａｓｅ－突变株 ＭＪ－１株的１８ｈ培养物（５ ×１０~６ＣＦＵ）接种健康鲫，不产生亲本 Ｊ－１株引起的病变及死亡。用ＭＪ－１活菌免疫鲫，在第５周产生...

以EPC细胞和HEp 2细胞为细胞模型 ,用嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila ,Ah)J 1株进行粘附试验 ,同时以Ah4型菌毛的抗血清作粘附抑制试验 ,用以分析AhJ 1株的粘附素及其受体。EPC细胞粘附和粘附抑制试验证实 ,AhJ 1株粘附素受体具有甘露糖、胆固醇成分 ,有少量半乳糖成分 ,无葡萄糖成分。HEp 2细胞粘附和粘附抑制试验证实 ,与其它非菌毛粘附素如S层及外膜蛋白相比 ,Ah 4型菌毛的粘附作用较为显著。抗 4型菌毛抗体抑制细菌的粘附力达 80 %以上。抗S层、外膜蛋白抗体也能使细菌的粘附力下降 ,表明Ah的粘附作用由菌毛粘附素与非菌毛粘附素共同参与。

LrrG蛋白是无乳链球菌较保守的表面蛋白之一。为获得罗非鱼源无乳链球菌LrrG蛋白并探讨其在罗非鱼体内的免疫原性,本实验根据GenBank中已报道的人源无乳链球菌LrrG基因序列,设计特异性引物,扩增获得罗非鱼源无乳链球菌的LrrG基因。分析表明,其ORF为2 361 bp,编码786个氨基酸,与人源无乳链球菌LrrG基因核苷酸序列的相似性高达98.48%。LrrG蛋白含有3个保守的LRR结构域,并可形成多个抗原表位。将LrrG基因片段克隆转入原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)/LrrG,E.coli BL21(DE3)22℃诱导表达6 h。SDS-PAGE显示...

将SARS冠状病毒(SARS-CoV)表面的主要结构蛋白刺突蛋白S144-643的基因片段(nt430-nt1929)克隆入表达质粒pET-28b中,并在大肠杆菌中表达。S144-643蛋白分子质量为55 ku左右,以包涵体形式存在于细菌中。ELISA及Western blot证明,S144-643可以与SARS康复病人的阳性血清发生特异性反应,免疫新西兰大白兔可以诱发产生较高水平的特异性抗体,因而证明原核表达的S144-643具有良好的免疫原性。

【目的】在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1-NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。【方法】PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD。将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度。在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5 d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况。将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况。【结果】PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDV S1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高。在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P0.05)。【结论】成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性。

根据已发表的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpU的基因序列设计1对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,自哈维氏弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段约1 000 bp的序列,构建重组载体pMD18-T-OmpU;测序结果表明,该基因与已发表的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU序列存在98%以上的相似性,该序列在GenBank上的登录号为FJ919231。构建表达质粒pET-30a(+)-OmpU后转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3),在IPTG诱导下实现高效表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约为41 ku,与预期基本相符。重组蛋白以包涵体形式表达。以脲素法得到...