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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李焕荣 陈怀青 陆承平
嗜水气单胞菌（Ａｈ）Ｊ－１株的液体培养物上清在５６℃或与乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）或丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）作用，其胞外蛋白酶（ＥＣＰａｓｅ）的活力有不同程度的下降。将酪蛋白掺入丙烯酰胺聚合后，加ＡｈＪ－１上清作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，３７℃原位消化，染色，显示上清中存在至少５种分子量不同的蛋白酶。ＡｈＪ－１株的培养上清经硫酸铵沉淀、ＤＥＡＥ－纤维素离子交换层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００分子筛层析，获得一种纯化的蛋白酶。不经２－巯基乙醇处理后，分子量约为５４０００，而经２－巯基乙醇处理的样品，分子量为３５０００，且酶活性丧失。该酶对热稳定，ＥＤＴＡ可抑制其活性，ＰＭＳＦ对其无影响。...
关键词：
嗜水气单胞菌 胞外蛋白酶 纯化 特性分析
[期刊] 水产学报
[作者]
黄小丽 汪开毓 耿毅 苏秀梅 陈德芳
采用硫酸铵盐析,DEAE Sephadex A-50凝胶层析等方法从嗜麦芽寡养单胞菌胞外产物中提纯了一种分子量为45.7ku的单一多肽蛋白酶。该酶对小鼠和斑点叉尾鮰具有明显的致死作用,其LD50分别为4.33μg.g-1体重和3.49μg.g-1体重。酶的最适温度为20℃,热稳定性差,100℃作用15min酶活完全丧失,最适pH为9.0,PMSF对酶活无影响,部分金属离子如Ca2+、Hg2+、Cu2+能使酶活性明显下降,而Co2+对酶有一定程度的激活作用,EDTA能完全抑制酶活性,表明该酶为一种金属蛋白酶。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
储卫华 陆承平
以提纯的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶 (ECPase)注射异育银鲫 ,鲫鱼出现典型的由嗜水气单胞菌引起的败血症症状 :病鱼体表充血、出血 ,鳃苍白 ,腹部膨大 ,肛门红肿突出 ,腹腔内有红色的腹水 ,肠壁充血发炎 ;背部肌肉注射部位发生液化、糜烂 ,鳞片竖起。病鱼各组织器官都有病变 ,其中尤以肝、肾最为严重 :肝脏肿大 ,质地脆弱 ,肝细胞水肿 ,胞浆结构疏松 ;肾小体坏死以至解体 ,肾小管上皮细胞也发生病变。体外试验表明 ,正常鲫鱼血清中有某种成分能够抑制蛋白酶的活性
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
储卫华 陆承平
对体外培养嗜水气单胞菌的胞外蛋白酶 (ECPase)产生条件进行了优化。结果发现 ,其产量与碳源、氮源、培养温度、培养基初始pH值等有关。蔗糖能促进蛋白酶的产生 ,NH4 + 抑制蛋白酶的产生。其最佳产酶条件为 :pH 7 5的0 0 2mol·L-1KC1,0 0 6mol·L-1K2 HPO4 ,5g·L-1的蔗糖和 5g·L-1的胰蛋白胨水 ,2 8℃ ,15 0r·min-1摇床培养 6 5h。在此条件下酶活性可达 2 0 8U·mL-1。
关键词：
嗜水气单胞菌 胞外蛋白酶 培养条件
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
孟喜龙 刘永杰 陆承平
对嗜水气单胞菌产弹性蛋白酶条件进行如下优化:用单因素法优化了氮源、碳源等培养基成分及温度和初始pH值等培养条件;用三因素三水平的正交试验对氮源浓度、碳源浓度、盐离子浓度进行优化。结果发现:较低浓度的氮源、碳源有利于酶的产生,表面活性剂能明显提高酶的产量。嗜水气单胞菌产弹性蛋白酶的最佳条件:胰蛋白胨5 g.L-1,蔗糖5 g.L-1,NaCl 2.5 g.L-1,K2HPO42.0 g.L-1,Tween-80 1 g.L-1,初始pH为7.5,28℃培养48 h。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
任燕 陆承平 姚火春
根据已发表的人源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)温敏胞外蛋白酶基因eprA1的核甘酸序列,设计合成一对引物,以嗜水气单胞菌鱼源株Ah J-1基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到1 005 bp的胞外蛋白酶基因eprJ1,将该基因片段连接到pMD18-T载体中,构建克隆载体pMD-eprJ1。序列分析发现,其与发表的Ah AH1的胞外蛋白酶eprA1基因的同源性有91%。根据测序结果在保守区重新设计一对引物以增强特异性,扩增片段大小为387 bp。对1990~2004年15年间从浙江、福建、湖北及江苏等地不同患病水产动物肝肾等脏器分离到的23株Ah检测结果显示,从...
[期刊] 水产学报
[作者]
储卫华 陆承平
根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列,设计和合成了一对引物,以嗜水气单胞菌AhJ-1的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段,并克隆到质粒载体pGEM-T中进行测序和分析,结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％,扩增片段编码343个氮基酸,推测的分子量为35700,计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性,可作为核酸疫苗的侯选基因片段。
关键词：
嗜水气单胞菌 丝氨酸蛋白酶基因 克隆
[期刊] 西南农业学报
[作者]
简思杰 晁嘉 孙薇 陈春琳 陆娟 刘勇 刘祥
【目的】旨在评价嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA2991的免疫学功能，为探索嗜水气单胞菌渔用疫苗候选抗原提供理论依据。【方法】通过生物信息学分析AHA2991氨基酸序列，揭示不同菌株间的亲缘关系；分子克隆构建AHA2991表达菌株并确定最佳诱导条件；包涵体洗涤及SDS-PAGE切胶纯化获得AHA2991并免疫红鲫；Western blotting检测AHA2991红鲫血清的特异性与效价；ELISA模拟AHA2991红鲫血浆与嗜水气单胞菌的体外相互识别作用；酸性、碱性磷酸酶（ACP、AKP）测定与细胞吞噬作用评价AHA2991非特异性免疫功能；组织病理学切片探究AHA2991免疫对红鲫内脏的影响情况。【结果】AHA2991蛋白家族在不同菌株间具有同源性，不同菌株间亲缘关系较近，尤其在气单胞菌间亲缘关系更近；AHA2991的最佳诱导条件为：菌液浓度OD_(600) =1.0，IPTG终浓度0.1 mmol/L，在28 ℃下诱导8 h。红鲫AHA2991抗血清具有良好的特异性，其效价为1:800；体外AHA2991血浆对嗜水气单胞菌具有识别作用，滴度可达1:3 200；ACP、AKP指标及细胞吞噬作用均显示AHA2991激活红鲫非特异性免疫；组织病理学切片表明AHA2991免疫对红鲫内脏结构无影响。【结论】嗜水气单胞菌AHA2991具有良好的免疫原性，有望成为嗜水气单胞菌渔用疫苗的候选抗原成分。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
朱友峰 岳寿松 宋爱荣 游银伟 尤升波 王翠萍
利用硫酸铵分级沉淀和交联葡聚糖G-100凝胶柱纯化了高效降解羽毛的嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1所产角蛋白酶,纯化的角蛋白酶,经SDS-PAGE蛋白电泳分析,分子量为48.3 kda。结果表明,该酶最适反应温度和最适pH值分别为50℃和9.0,30～40℃具有较好的温度稳定性,60℃酶活下降很快;在pH 7.0～9.5的范围内具有较好的稳定性。金属离子Ni2+、Zn2+对角蛋白酶具有明显抑制作用,Cu2+、Fe2+、Fe3+能完全抑制酶活;1%巯基乙醇对酶具有明显激活作用。EDTA和PMSF对该角蛋白酶几乎完全抑制,可判定该酶是丝氨酸金属蛋白酶,是一种新的蛋白酶。
关键词：
角蛋白酶 嗜麦芽窄食单胞菌 性质 纯化
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
朱杰青 吉传义 陆承平
利用蛋白酶的溶蛋白特性 ,结合琼脂免疫扩散试验 ,建立了脱脂奶溶蛋白琼脂扩散抑制试验的新方法 ,用以检测兔血清中的嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophilla)胞外蛋白酶抗体。同时与琼脂扩散免疫沉淀试验及ELISA试验进行了比较 ,结果显示 ,该方法的敏感性优于琼脂扩散免疫沉淀试验 ,而与ELISA试验相当
关键词：
嗜水气单胞菌 胞外蛋白酶 抗体 检测
[期刊] 中国水产科学
[作者]
董传甫 林天龙 俞伏松 龚晖
用十二烷酰肌氨酸盐抽提结合超速离心纯化,制备了19株典型嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和1株温和气单胞菌(A.sobria)的主要外膜蛋白(MOMP)。根据SDS-PAGE图谱,将其中的14株菌分为3个MOMP组,Ⅰ组的主要蛋白带为40 kD和43 kD,Ⅱ组的主要蛋白带为40 kD和50 kD,Ⅲ组的主要蛋白带为40 kD、46 kD和50kD。MOMP组和血清型间没有严格的关系。用兔抗嗜水气单胞菌体抗原为第一抗体进行免疫印迹实验,结果显示,所有被试菌株都能产生强阳性反应,其中40 kD的蛋白带为大多数菌株所共有,且具有相似的免疫原性,是构成菌体抗原的重要免疫原。用...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈吉祥 刘霜 李筠 王祥红 杜宗军 于德华 纪伟尚 徐怀恕
从山东省莱州海区自然发病的花鲈 (Lateolobraxjapanicus)体内分离到 1株致病性鳗弧菌 ,经硫酸铵盐析、DEAE SepharoseFastFlow和Sephadex G10 0凝胶层析等方法从其培养液中分离纯化了 1种胞外蛋白酶。用SDS PAGE电泳测得蛋白质的分子量为 36 7kD ,酶的最适温度为 5 0℃ ,对热不稳定 ,70℃ 15min完全失去活力 ;最适pH为 7 0 ;1mmol/L的PMSF对酶活性无影响 ,部分金属离子如Cu2 + 、Fe2 + 、Fe3 + 、Zn2 + 对酶活力有抑制作用 ,而Ca2 + 对酶有一定程度的激活作用 ,1mmol/LE...
关键词：
鳗弧菌 胞外蛋白酶 分离纯化 理化性质
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
许冬青 陆承平 陈怀青
致病性嗜水气单胞菌(Aerom onashydrophila, Ah) J-1 株具有S层结构。用甘氨酸缓冲液处理AhJ-1 株菌体细胞,离心, 上清即为粗提的S蛋白。用自制兔抗AhJ-1 株S蛋白抗体建立间接ELISA法, 检测结果显示, 20～30 h S蛋白表达量较高。粗提的S蛋白经离心、Sephadex G100 凝胶层析获纯化的S蛋白。经SDS-PAGE电泳分析为单一多肽, 相对分子质量51 500。等电聚焦分析为单一条带, 等电点 (pI) 为5.01。氨基酸组分分析表明, S蛋白由天门冬氨酸等16种氨基酸组成, 其中疏水性氨基酸占42.1% , 不含半胱氨酸。N端序列分析结果为A...
关键词：
嗜水气单胞菌 S蛋白 N端测序
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
陈怀青 陆承平
用甘氨酸缓冲液处理对鱼类致病的嗜水气单胞菌代表菌株 Ah J-1菌体细胞,可使该菌表层蛋白(S层)成片脱落。电镜观察发现,S 层是由四边形的蛋白亚单位呈晶格样排列而成。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,该蛋白的分子量约50k;免疫印迹显示,它是 Ah J-1的主要表面抗原。另将 Ah J-1用 Triton X-100选择性抽提,经 SDS-PAGE,在考马斯亮蓝染色图谱中显示其外膜蛋白(OMP)为3条主要蛋白带,分子量分别为34,46和58k.
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
严亚贤 孙建和 陈怀青 陆承平
用电镜观察嗜水气单胞菌Ｊ－１株，见有两种不同的菌毛，一种为短而硬直的Ｒ菌毛，另一种为长而易弯曲的Ｗ菌毛。Ｒ菌毛数量多，周身分布；Ｗ菌毛数量少，一个菌体仅４～６根。搅拌菌体悬液可使菌毛脱落，低速离心的上清液经ＰＥＧ沉淀、硫酸铵盐析和Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ层析后，获得纯化的Ｒ菌毛。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示，在有２－巯基乙醇存在时，Ｒ菌毛的亚单位分子量为１７０００。氨基酸组分分析表明，Ｒ菌毛含有４１％的疏水性氨基酸。用纯化的Ｒ菌毛免疫家兔获抗血清，建立菌体凝集试验和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法，检测５０个待检样本的Ｒ菌毛，两法检出率均超过６０％，符合率为８８％。
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