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[期刊] 水产学报
[作者]
姜洲 薛亚果 张猛 朱雷 王磊 李学军 董传举
为解析鲤Slc15a2在嗜水气单胞菌侵染过程中对免疫应答机制的影响，本实验通过制备鼠源Slc15a2-1和Slc15a2-2多克隆抗体后，采用酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）检测嗜水气单胞菌感染后鲤血清中Slc15a2-1和Slc15a2-2蛋白表达变化发现，①感染后2个拷贝的最高蛋白表达水平与正常组相比，分别增加了4.81和2.48倍；且Slc15a2-2的表达量与Slc15a2-1相比从0 ～ 48 h一直处于较高表达水平。②从整体方面来看，在Slc15a2的2个拷贝之间具有相似的表达趋势，均为先升高后降低再升高再降低；但Slc15a2-1在3 h达到第1个表达高峰，而Slc15a2-2则在6 h达到第1个表达高峰。3、6 ～ 24h的4个时期中，Slc15a2-1和Slc15a2-2蛋白表达呈现互补的表达趋势，即在同一时期一个拷贝的表达量显著下降，另一个拷贝的表达量显著升高，但总体维持较高表达水平。结果表明，本实验制备的鼠源Slc15a2-1和Slc15a2-2多克隆抗体具有较高的亲和力和特异性，当鲤受到嗜水气单胞菌侵染后，2个拷贝之间整体具有相似的表达趋势说明可能具有相似的基因功能；Slc15a2-1虽在3 h时率先做出低表达量响应，但与Slc15a2-1相比，Slc15a2-2在0 ～ 48 h之间具有显著的高表达量，可能是作为该基因拷贝中的主效基因，并且6 ～ 24 h时，2个拷贝就一直呈现互补的表达方式，共同表达量维持在高水平，面对病原侵害时能做有效响应。本研究可为深入了解鲤Slc15a2的免疫防御机制提供一定的研究基础。
关键词：
鲤 Slc15a2 抗体 嗜水气单胞菌
[期刊] 水产学报
[作者]
姜洲 薛亚果 张猛 朱雷 王磊 李学军 董传举
为解析鲤Slc15a2在嗜水气单胞菌侵染过程中对免疫应答机制的影响，本实验通过制备鼠源Slc15a2-1和Slc15a2-2多克隆抗体后，采用酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）检测嗜水气单胞菌感染后鲤血清中Slc15a2-1和Slc15a2-2蛋白表达变化发现，①感染后2个拷贝的最高蛋白表达水平与正常组相比，分别增加了4.81和2.48倍；且Slc15a2-2的表达量与Slc15a2-1相比从0 ～ 48 h一直处于较高表达水平。②从整体方面来看，在Slc15a2的2个拷贝之间具有相似的表达趋势，均为先升高后降低再升高再降低；但Slc15a2-1在3 h达到第1个表达高峰，而Slc15a2-2则在6 h达到第1个表达高峰。3、6 ～ 24h的4个时期中，Slc15a2-1和Slc15a2-2蛋白表达呈现互补的表达趋势，即在同一时期一个拷贝的表达量显著下降，另一个拷贝的表达量显著升高，但总体维持较高表达水平。结果表明，本实验制备的鼠源Slc15a2-1和Slc15a2-2多克隆抗体具有较高的亲和力和特异性，当鲤受到嗜水气单胞菌侵染后，2个拷贝之间整体具有相似的表达趋势说明可能具有相似的基因功能；Slc15a2-1虽在3 h时率先做出低表达量响应，但与Slc15a2-1相比，Slc15a2-2在0 ～ 48 h之间具有显著的高表达量，可能是作为该基因拷贝中的主效基因，并且6 ～ 24 h时，2个拷贝就一直呈现互补的表达方式，共同表达量维持在高水平，面对病原侵害时能做有效响应。本研究可为深入了解鲤Slc15a2的免疫防御机制提供一定的研究基础。
关键词：
鲤 Slc15a2 抗体 嗜水气单胞菌
[期刊] 水产学报
[作者]
姜洲 薛亚果 张猛 朱雷 王磊 李学军 董传举
为解析鲤质子转运载体15a2 (Slc15a2)在嗜水气单胞菌侵染过程中对机体免疫应答机制的影响，实验通过制备鼠源Slc15a2-1和Slc15a2-2多克隆抗体，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术检测嗜水气单胞菌感染后鲤血清中Slc15a2-1和Slc15a2-2蛋白表达变化。结果显示，(1)感染后2个拷贝的最高蛋白表达水平与空白对照组相比，分别增加了4.81和2.48倍；与Slc15a2-1相比Slc15a2-2的表达量从0～48 h一直处于较高表达水平。(2)从整体来看，Slc15a2的2个拷贝具有相似的表达趋势，均为先升高后降低、再升高再降低；但Slc15a2-1在3 h达到第1个表达高峰，而Slc15a2-2则在6 h达到第1个表达高峰。(3) 6～24 h的4个时期中，Slc15a2-1和Slc15a2-2蛋白表达呈现互补的表达趋势，即在同一时期一个拷贝的表达量显著下降，另一个拷贝的表达量显著升高，但总体维持较高表达水平。结果表明，本实验制备的鼠源Slc15a2-1和Slc15a2-2多克隆抗体具有较高的亲和力和特异性，当鲤受到嗜水气单胞菌侵染后，2个拷贝整体具有相似的表达趋势，说明可能具有相似的基因功能；与Slc15a2-1相比，Slc15a2-2在0～48 h之间具有显著的高表达量，推测该基因为2个拷贝中的主效基因，并且6～24 h时，2个拷贝一直呈现互补的表达方式，导致Slc15a2表达量维持在高水平，面对病原侵害时能做有效响应。本研究为深入了解鲤Slc15a2的免疫防御机制提供一定的研究基础。
关键词：
鲤 Slc15a2 抗体 嗜水气单胞菌
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杜娜 顾泽茂 袁军法 林蠡 翟艳花 刘学芹 罗宇良
根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气溶素(aerolysin,Aer)基因的序列设计引物,以来自湖北的鱼源A.hydrophila分离株为模板扩增出aer基因的ORF序列,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定。测序结果表明,A.hydrophila的aer基因的系统进化树中国内菌株聚为一支,国外菌株聚为一支。通过pET-32a(+)载体构建Ah15株aer基因的表达载体pET32a-15,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约72.2ku相吻合的融合蛋白带,且以包涵体形式存在。浓缩后的...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
蒋蔚 刘永杰 陆承平
以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)J-1株基因组为模板,根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物,扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a(+)中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明,插入片段长度为948bp,与NCBI上登录的几个相关序列相比,同源性在93.1%~95%之间,缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21(DE3),经诱导可表达分子量约57.4kD的蛋白,凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50%以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清...
[期刊] 水产学报
[作者]
龚晖 林天龙 俞伏松 董传甫 陈日升 杨金先 陈振海
应用PCR技术,从1株鳗源嗜水气单胞菌ML316中扩增得到β 溶血素基因AHL316HEM,将AHL316HEM克隆到pGEM TEasyVector,经分析验证后重组到pcDNA3.0中,构建了重组质粒PDLH。转化重组质粒PDLH的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α能在血琼脂培养皿中形成明显的β 溶血斑,重组菌纯化的胞外产物溶血价为1.28×104HU·mg-1,同时重组菌的胞外产物能被原始菌株的高免血清特异性地识别。结果证实,克隆到鳗源嗜水气单胞菌β 溶血素基因,重组质粒PDLH能够表达具有天然生物学活性的β 溶血素,为构建嗜水气单胞菌核酸疫苗奠定了基础。
关键词：
嗜水气单胞菌 β-溶血素基因 克隆 表达
[期刊] 西南农业学报
[作者]
荣娜 康超 孙薇 简思杰 伍娜娜 刘祥
【目的】本文研究了淡水养殖主要病原菌嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpK的免疫学功能,为相关疫苗开发奠定理论基础。【方法】采用生物信息学分析OmpK蛋白的理化性质、结构与功能;利用分子克隆构建OmpK蛋白表达菌株,结合L_9(3~4)正交实验确定其最佳诱导表达条件,通过包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化OmpK蛋白;Western blot检测抗血清特异性与效价,ELISA检测OmpK蛋白抗血清对嗜水气单胞菌的体外识别;Western blot分析OmpK蛋白抵抗鱼血浆的杀菌作用。【结果】OmpK为亲水性蛋白,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构呈桶状,在气单胞菌属间同源性较高,进化相对保守;成功构建OmpK表达菌株,并获得较高纯度的OmpK蛋白,其最佳表达条件为:诱导时菌液浓度OD_(600)=1.0,IPTG浓度为0.5 mmol/L,28℃诱导8 h; Western blot验证OmpK蛋白抗血清特异性较好,且效价达到1∶1600,ELISA显示OmpK蛋白抗血清与嗜水气单胞菌存在体外相互作用;Western blot发现OmpK蛋白可通过表达下调实现抵抗鱼血浆的杀菌作用。【结论】原核表达的OmpK蛋白,可刺激机体产生特异性抗体,与嗜水气单胞菌存在体外相互作用。此外,OmpK蛋白可有效抵抗鱼血浆对嗜水气单胞菌的杀菌作用。本研究为嗜水气单胞菌OmpK蛋白的免疫作用研究与疫苗的开发奠定基础。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘佳佳 吴志新 石焱 姚卓凤 李景 彭小云 陈孝煊
在饲料中添加0.2%甘露寡糖(Mannan oligosaccharide,(MOS)),饲养草鱼(Ctenopharyngodon idellus)28 d后,草鱼经腹腔注射3.2×106cell/mL的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)0.1 mL,在注射嗜水气单胞菌48 h、72 h和96 h后,分别取草鱼头肾、脾脏和肝脏,利用荧光定量PCR分析甘露寡糖对草鱼感染嗜水气单胞菌后各组织中IL-1β和IL-10的表达影响。结果显示,在草鱼头肾中,MOS/I(0.2%甘露寡糖+注射Ah)组IL-1β的表达在注射嗜水气单胞菌后48 h和72 h显著高于CON/I(基础...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
彭小云 刘红 陈孝煊 张棋 袁娟 刘佳佳 吴志新
将嗜水气单胞菌粗脂多糖(C-LPS)和大肠杆菌脂多糖(E-LPS)分别经腹腔注射草鱼(剂量为4mg/kg),以注射PBS为对照。48h后,分别提取各组草鱼的头肾、脾脏、肾脏、肝脏和肠组织中的总RNA,利用Real-time PCR的方法检测不同组织中TNF-α、IL-1β、IL-10和TLR4基因的表达情况。结果显示,与对照组相比,头肾中,TNF-α和IL-1β的表达量在E-LPS组显著升高,而IL-10的表达显著下降;C-LPS组TNF-α和IL-10的表达量显著性升高;TLR4在两试验组均有显著性降低。脾脏中,TNF-α、IL-1β和IL-10在E-LPS组与对照组无显著差异,而IL-1β...
[期刊] 水产学报
[作者]
赵林辉 田佳鑫 孔祎頔 彭思博 单晓枫 王桂芹
为构建嗜水气单胞菌OmpA、flaA基因重组干酪乳杆菌并分别检测其表达产物的对鲤的生长及免疫效果的影响；实验将目的基因克隆至乳酸菌穿梭表达质粒pPG612中，并电转至干酪乳杆菌中，经诱导后包被饲料对鲤进行饲养56 d，称重并采集血清及组织，分析生长指标及免疫指标变化。在56d饲养免疫结束后结果显示，生长指标表明重组干酪乳杆菌与对照组相比无显著性差异，其表明对生长无影响；免疫效果分析显示，血清中IgM 表达水平显著上升；血清中AKP、LZM、SOD、CAT、C3和C4也均有显著性升高，荧光定量PCR检测发现免疫后肝、脾、肾及肠组织中的细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α、NF-kB、TLR5及MYD88的基因表达水平有明显的不同程度提升；其TLR5及MYD88表达量Lc-mcs-flaA组高于Lc-mcs-OmpA组；攻毒后Lc-mcs-OmpA与Lc-mcs-flaA免疫保护率分别为59%与54%，显著高于对照组。研究表明，本实验构建的重组干酪乳杆菌Lc-mcs-OmpA与Lc-mcs-flaA免疫鲤能刺激机体产生免疫应答反应，进而提高自身存活率，其为预防鱼类嗜水气单胞菌感染的口服免疫制剂的研发奠定了基础并提供科学理论依据。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
陈怀青 陆承平
用甘氨酸缓冲液处理对鱼类致病的嗜水气单胞菌代表菌株 Ah J-1菌体细胞,可使该菌表层蛋白(S层)成片脱落。电镜观察发现,S 层是由四边形的蛋白亚单位呈晶格样排列而成。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,该蛋白的分子量约50k;免疫印迹显示,它是 Ah J-1的主要表面抗原。另将 Ah J-1用 Triton X-100选择性抽提,经 SDS-PAGE,在考马斯亮蓝染色图谱中显示其外膜蛋白(OMP)为3条主要蛋白带,分子量分别为34,46和58k.
[期刊] 西南农业学报
[作者]
简思杰 晁嘉 孙薇 陈春琳 陆娟 刘勇 刘祥
【目的】旨在评价嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA2991的免疫学功能，为探索嗜水气单胞菌渔用疫苗候选抗原提供理论依据。【方法】通过生物信息学分析AHA2991氨基酸序列，揭示不同菌株间的亲缘关系；分子克隆构建AHA2991表达菌株并确定最佳诱导条件；包涵体洗涤及SDS-PAGE切胶纯化获得AHA2991并免疫红鲫；Western blotting检测AHA2991红鲫血清的特异性与效价；ELISA模拟AHA2991红鲫血浆与嗜水气单胞菌的体外相互识别作用；酸性、碱性磷酸酶（ACP、AKP）测定与细胞吞噬作用评价AHA2991非特异性免疫功能；组织病理学切片探究AHA2991免疫对红鲫内脏的影响情况。【结果】AHA2991蛋白家族在不同菌株间具有同源性，不同菌株间亲缘关系较近，尤其在气单胞菌间亲缘关系更近；AHA2991的最佳诱导条件为：菌液浓度OD_(600) =1.0，IPTG终浓度0.1 mmol/L，在28 ℃下诱导8 h。红鲫AHA2991抗血清具有良好的特异性，其效价为1:800；体外AHA2991血浆对嗜水气单胞菌具有识别作用，滴度可达1:3 200；ACP、AKP指标及细胞吞噬作用均显示AHA2991激活红鲫非特异性免疫；组织病理学切片表明AHA2991免疫对红鲫内脏结构无影响。【结论】嗜水气单胞菌AHA2991具有良好的免疫原性，有望成为嗜水气单胞菌渔用疫苗的候选抗原成分。
[期刊] 水产学报
[作者]
王俊丽 闫潇 卢荣华 秦超彬 梁丽娜 刘燕琴 聂国兴
[期刊] 水产学报
[作者]
欧阳岁东 林天龙 陈孝煊 俞伏松 龚晖 陈红燕 方勤美
A pair of primers were designed according to the published nucleotide sequence of a putative outer membrane protein gene(omp) of Aeromonas hydrophila.With the specific primers,a target fragment about 1.1 kb was amplified from Aeromonas hydrophila ML316 via PCR.The target fragment was inserted into t...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
郑宗林 郑曙明 Delbert M.Gatlin Ⅲ 汪开毓
为评价嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)PDK06株外膜蛋白A(omp A)的原核表达产物是否具有抗原性及其对斑点叉尾(Ictalurus punctatus)的免疫保护力,根据Gen Bank上嗜水气单胞菌外膜蛋白omp A基因序列(Gen Bank登录号:AF146597)设计去信号肽引物,扩增获得一段约1 000 bp的序列,经鉴定正确后,构建重组表达质粒p ET-32a(+)-pomp A;然后将该质粒转入BL21(DE3)后用IPTG诱导表达,经纯化后得到pomp A重组蛋白;最后将pomp Aomp A蛋白与弗氏不完全佐剂(FIA)混合免疫斑点叉尾,评价...
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