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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
苏春霞 苏鑫铭 张彦明 曹瑞兵 周斌 陈溥言
为进一步提高重组病毒的表达水平,用构建的含gB启动子和NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体pUS10F转染293T细胞,通过PCR和接免疫荧光(IFA)法研究了其在真核中的表达,并确定最佳的转染条件。结果表明,真核细胞中带有F基因,转移质粒载体已经进入细胞DNA;转染转移质粒载体 pUS10F后的293 T细胞所表达的NDV F基因产物抗原性较好,能够与抗NDV的标准血清反应。确定的最佳转染条件为:DNA 3μg／mL,转染后48 h外源基因在细胞中的表达量最高,在6孔板和96孔板中细胞数量分别以 2×105／孔和1×101／孔的转染效果最好。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
苏春霞 张彦明 张雪莲 徐学清 陈溥言
将新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因1700bp克隆到真核表达载体pIRES中,构建成表达F基因的载体pIRESF,然后将包含F基因及其上游的内含子和下游的polyA的2900bpDNA片段再克隆入包含gB启动子的SK载体中,并使其克隆到gB启动子600bp的下游,最后将包含gB启动子和F基因表达盒3500bp克隆到包含MDVCVI988非必须片段US10的载体SK中。该研究为进一步在细胞中转染并获得表达F基因的MDVCVI988重组病毒奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
贾红梅 常维山 宋文刚 柴家前 孙英峰
为了研究胸腺五肽基因的免疫增强作用,根据GenBank收录的新城疫病毒(NDV) F基因序列,设计1对特异性引物,其中上游引物含有胸腺五肽(Thymopentin,TP-5)的基因序列。以NDV Z株F基因的重组质粒为模板进行PCR扩增,扩增产物与真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO重组,构建了真核共表达质粒pcDNATP-5NDVZF。将重组质粒pcDNATP-5NDVZF、pcDNANDVZF分别以100μg/只的剂量免疫小鼠,用间接ELISA法和MTT法检测其免疫原性。结果表明,重组质粒均能在小鼠体内诱导相应的体液免疫和细胞免疫,其中pcDNATP-5NDVZF的作用较p...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
邱亚峰 葛菲菲 陈溥言
【目的】为了构建MDV1细菌人工染色体,以便快速有效地进行重组病毒的筛选,进行了含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型(MDV1)转移载体的构建。【方法】利用DNA重组技术,构建了含有E.coli F因子的马立克氏病病毒1型(MDV1)转移载体,利用脂质体,将线性化的转移载体转染入已感染CVI988病毒的CEF,用MX-HAT药物筛选3代以后,用X-gal染色,挑取阳性克隆。【结果】经测序分析发现,人工体外合成的单一loxP位点,序列正确,另外,同源重组左臂和右臂序列正确,并且相对连接。利用SphⅠ和NheⅠ双酶切,鉴定出含有同向LoxP位点的转移载体,将其命名为pUS-BGS。将该载体用...
关键词：
马立克氏病病毒 细菌人工染色体 F因子
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
程相朝 吴志明 吴庭才 李银聚 张春杰 李祥瑞
从1998~2002年河南省洛阳地区代表性新城疫发病禽群中分离鉴定了15株新城疫病毒(NDV),并对其生物学特性进行了研究。结果表明,15株NDV均呈现良好的血凝活性和特异的血凝抑制特性;对鸡胚的致病作用可被新城疫阳性血清所抑制;对鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT),1日龄雏鸡脑内接种的致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉内接种的致病指数(IVPI)的测定证实,LD-6-01和LR-2-00株是弱毒株,其余均为强毒株;弱毒株的血凝素热稳定性较好,属慢速血凝解脱型;强毒株的血凝素热稳定性差,属快速或中速血凝解脱型;所有毒株均可较好地凝集鸡和人(O型血)的红细胞,但对其他动物的红细胞凝集性差异较...
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
孙晓红 姚泉洪 陈明杰 潘迎捷
分别用限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切质粒pBGgHg,将切下的含双孢蘑菇gpd启动子、EGFP基因和35S终止子的碱基序列连接到含Ap抗性的pBSK II上,再将这一段序列切下连接到含kan抗性的pCAMBIA1300载体上,形成中间质粒载体YH2873。用限制性内切酶HindIII分别酶切质粒YH2873和质粒pDB06,将从pDB06切下的trp3iar基因连接到中间质粒载体YH2873上,得到表达载体pSAGF。中间载体pYH2873经限制性内切酶EcoR I和HindIII酶切,电泳后显示1.3 kb的目的片断和9 kb的载体片断,表达载体pSAGF经限制性内切酶Hind...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
余世聪 梁浩 李壮
【目的】BnaLCR78是一个来源于甘蓝型油菜的候选基因,实验主要探究其与种子脂肪酸积累相关性。【方法】利用同源克隆获得BnaLCR78基因片段,使用定量PCR技术检测其表达特征并构建其植物表达载体。【结果】获得了长度为376 bp的基因组序列,与油菜基因组数据库中预测的一个类防御素(defensin-like protein)核苷酸水平上的同源性达到98%,属于LCR(low-molecular-weight cysteine-rich)基因家族。从高油酸材料中,获得2种长度分别为376和237 bp的
关键词：
甘蓝型油菜 脂肪酸 基因 LCR
[期刊] 华北农学报
[作者]
冯雪 贾永红 郭红珍 张一名 赵学良 孙艳香
应用DNA重组技术将编码大豆液泡膜Na+/H+反向转运蛋白GmNHX1和百脉根液泡膜H+-PPase LcVP1的开放阅读框片段同时构建在pCambia1301载体中,形成p1301-GmNHX1-LcVP1双价耐盐基因植物表达载体。以Coker 312棉花品种的胚性愈伤组织为外植体,采用根癌农杆菌介导法将其转入棉花中,并利用潮霉素筛选获得抗性植株。对抗性植株的T1幼苗进行分子和生理指标检测,表明外源基因已成功整合到棉花基因组中,并不同程度地提高了转基因株系耐盐能力。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
刘艳玲 向凤宁
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李玺洋 梁旭方 程炜轩 瞿春梅 张进
采用荧光定量的方法对不同季节广州显岗水库鲮(Cirrhinus molitorella)和尼罗罗非鱼(Oreochro-mis niloticu)肝脏中去毒酶基因谷胱甘肽转移酶GST基因的表达情况,并结合不同季节鱼类摄入蓝藻量进行研究,旨在了解鱼体中GST基因的表达量与水体中蓝藻含量的内在联系。结果表明,4月份水库蓝藻暴发,也是鲮和尼罗罗非鱼摄食产毒蓝藻量最多的月份。GST基因的表达情况是:4月份鲮GST基因表达量比其他月份低,可能与鲮对有毒蓝藻的敏感性和耐受力有关,4月份尼罗罗非鱼GSTA及GSTR2表达量最高;其他月份,鲮GSTT表达量最高,而GSTK表达量较低,尼罗罗非鱼GSTA及GST...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
温建新 李俊 周顺 任慧英 刘文华 邹玲 徐文 牛钟相 王金宝 吴家强
【目的】提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSVORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5。【方法】经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSVGP5蛋白。免疫SPF小鼠,检测鼠的特异性抗体滴度、脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平。【结果】本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫。【结论】CpG-ODN可提高PRRSV基因疫苗的免疫效果。
[期刊] 水产学报
[作者]
师红亚 董浚键 张德锋 孙成飞 田园园 卢迈新 叶星
为了解尼罗罗非鱼无乳链球菌(GBS)荚膜多糖合成基因的表达及其与荚膜唾液酸含量、菌株致病性的关系,本实验克隆了尼罗罗非鱼荚膜多糖合成基因cps E、cps K和neu A,通过q RT-PCR方法分析了这3个基因在不同培养温度下表达水平的变化,同时通过比色法测定了不同培养温度下GBS荚膜唾液酸含量的变化,通过人工感染实验分析了不同水温条件下GBS对罗非鱼的致病性。结果显示,cps E、cps K和neu A编码的氨基酸序列均具有保守的与荚膜多糖合成相关的酶活性位点,Cps E、Neu A与已知鱼源GBS(
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
梁荣奇 郝贵霞 尤明山 宋印明 张爱民 刘广田
选用 6个 T型不育系及其相应的保持系与 5个恢复系配制了 30个 T质杂种和 30个相应的 A质杂种、选用 4个 K型不育系及其保持系与 2个 K型恢复系配制了 8个 K质杂种和 8个相应的 A质杂种、选用 6个普通品种配制了 5个化杀组合 ,以研究杂种小麦籽粒的蛋白质含量和面团流变特性在 F1和 F2 中的表现。结果表明 :1胞质杂种 F1和 F2 籽粒蛋白含量均呈近正态分布 ;78%的组合 F1籽粒以超高亲为主 ,12 %的组合表现倾高亲 ;F2 籽粒以超高亲和偏高亲为主 ,约有 2 5%的组合表现近中亲。普通品种间的化杀杂种 F1籽粒以偏高亲和超高亲为主 ,F2 籽粒以近中亲和偏高亲为...
关键词：
杂种小麦 籽粒蛋白质含量 面团流变特性
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李明泽 程奇
【目的】fao1编码Candida cloacae中一种含铁辅基的长链脂肪醇氧化酶。通过构建该基因的衣藻核转化表达载体进行转化,根据表达蛋白的生物活性判断fao1能否充分利用衣藻叶绿体中的铁元素行使功能;同时也为需铁固氮酶基因的研究提供方向。【方法】通过PCR把PsaD信号肽、fao1、His-tag标签融合,连接到pDBle载体上;采用玻璃珠转化法,将重组子导入莱茵衣藻(CW15)中;经博来霉素筛选后,获得转基因植株。运用PCR和RT-PCR法检测了转化衣藻,并且用亲和层析柱纯化蛋白,同时进行FAO1活性检测。【结果】重组质粒测序完全正确;PCR和RT-PCR检测转化衣藻基因组DNA和RNA...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李占省 刘玉梅 方智远 杨丽梅 庄木 张扬勇 吕红豪
【目的】克隆青花菜细胞色素家族P450CYP79F1,分析其序列特征,阐明其在不同发育时期器官中的表达情况及其与莱菔硫烷含量的关系,为进一步揭示莱菔硫烷合成机理提供科学依据,为青花菜品种改良和新品种选育奠定基础。【方法】通过5′和3′端RACE克隆技术获得青花菜CYP79F1全长序列,利用DNAMAN 6.0进行基因拼接、氨基酸序列分析和蛋白二级结构预测,结合在线分析程序和软件进行基因和编码蛋白生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究CYP79F1在不同发育器官中的表达情况;结合HPLC方法测定各相应时期器官中莱菔硫烷含量,包括青花菜发育时期的根、茎、叶,成熟花球,抽薹期花蕾(顶端蕾、成熟蕾、开花前1 d的蕾和花)和种子;对CYP79F1表达量与和莱菔硫烷含量进行相关性分析。【结果】获得了CYP79F1全长序列,Gen Bank登录号为MG012890,该基因全长2 014 bp,包含一个1 620 bp的开放读码框(ORF),编码540个氨基酸;编码的蛋白与甘蓝、白菜、芥蓝和油菜等同源蛋白的相似性均在95%以上;生物信息学分析表明该基因编码的酶蛋白有2个信号肽和2个跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质中;CYP79F1在根和茎中的表达量较高,叶中表达量最低,在花器官发育时期,自顶端蕾到花发育过程中呈现逐渐降低的表达趋势,种子中该基因表达量与花处于同一水平。Pearson相关性分析显示,青花菜发育时期的根、茎、叶、成熟花球、抽薹期花蕾和种子中莱菔硫烷含量与CYP79F1表达量无显著相关关系,但抽薹期花蕾自顶端花蕾到花中莱菔硫烷生成量与CYP79F1表达量呈显著正相关关系(R=0.96,P<0.05),CYP79F1在调控莱菔硫烷的生成方面起重要作用,尤其是在生殖器官花蕾的发育过程中,能够显著上调莱菔硫烷的生成量。【结论】CYP79F1在青花菜不同发育器官中对莱菔硫烷的生成发挥着重要调控作用,可能与青花菜不同器官中莱菔硫烷含量多样性密切相关。
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