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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
罗满林 陈溥言 张林元 蔡宝祥 邓小昭
含有马立克氏病病毒糖蛋白Ｂ基因重组质粒的改造及其鉴定罗满林，陈溥言，张林元，蔡宝祥，邓小昭（南京农业大学动物医学院，２１００９５；南京军区军事医学研究所）ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮＡＮＤＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴＰＬＡＳＭＩ...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
罗满林 陈溥言 张林元 蔡宝祥 邓小昭
将马立克氏病病毒(MDV)GA 株基因文库中 BamH I I_3和 K_3克隆片段分别用 BamH I 加 Sal I 和 BamH I加 EcoR I 双酶切消化。含有编码 MDV 糖蛋白 B(gB)部分 DNA 的2.B kb、BamH I-Sal I 片段和1.1kb、BamH I-EcoR I 片段与 Sal I-EcoR I 消化的载体 pUR 222通过三聚体连接方式相连接。限制性核酸内切酶分析表明,重组质粒含有 MDV gB 基因,并且 MDV GA 株 gB 基因克隆在 EcoR I,Hind,Ⅲ,Xba I 和 Sal I 切点与 MDVRBIB 株相同。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
缪德年 王秀花 封江南 姚惠娟 吴琼杉 樊生超 陈溥言
以马立克氏病病毒超强毒(RB1B株)UL49为靶基因,利用计算机辅助设计UL49基因特异的siRNA,再定向克隆至pSilencerTM2.1U6neovector载体中构建siRNA表达重组体,转化DH5α菌株,提取质粒酶切鉴定后,进行测序分析,证实为所需序列。以上结果表明,针对马立克氏病超强毒UL49基因的siRNA表达质粒已构建成功。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
吴贤福 蔡宝祥 陈溥言
将ＭＤＶＧＡ株ＢａｍＨＩ基因文库中含Ｉ３片段的质粒ｐＡＣＹＣ１８４和Ｋ３片段的质粒ｐＨＣ７９扩增。用碱裂解法抽提质粒后，利用相应的限制性内切酶切出目的基因片段，连接到合适的载体上，构建了完整的ＭＤＶＢ抗原基因克隆载体。通过内切酶分析、地高辛（ＤＩＧ）—探针原位杂交、ＤＮＡ序列测定，确认克隆的Ｂ抗原基因正确。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨艳艳 王丽 杨继飞 郅玉宝 滕蔓 邓瑞广 肖治军 张改平
利用RT-PCR技术,将狂犬病病毒株ERA株糖蛋白胞外区基因分两段进行扩增,经克隆与序列分析,两片段大小分别为523,381 bp,各编码174,127个氨基酸,分子量分别为19.7,14.5 kDa。在原核表达载体pET-43a中分别克隆了这两段糖蛋白基因,将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为94,89kDa处分别出现新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。两重组蛋白主要以可溶形式表达,利用Ni2+亲和层析柱纯化了蛋白,纯度大于95%。Western-Blot分析结果显示,两种重组融合蛋白均可与兔抗RBV多抗血清反应,具有良好的反应原性。
关键词：
狂犬病病毒 糖蛋白 胞外区 纯化
[期刊] 华北农学报
[作者]
周雪媚 霍惠玲 佘锐萍 李永清 冯国民 章振华 王宏俊
本试验首先用RT-PCR方法扩增出H9N2亚型禽流感病的HA基因,大小约1 700 bp,将其克隆到真核表达载体pcDNA中,并将该真核表达载体上的CMV启动子控制的含LacZ和HA基因表达盒克隆入马立克氏病病毒US2基因中,成功的构建了马立克氏病病毒的转移载体。然后,通过脂质体方法转染已感染马立克氏病病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过蓝斑筛选获得重组病毒。该重组病毒通过PCR方法鉴定证实其基因组中含有完整的HA基因。免疫酶反应和Western-blot证实重组病毒表达了禽流感HA蛋白,表达的HA蛋白具有血凝活性。
关键词：
禽流感病毒 HA基因 重组马立克氏病病毒
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
付峰 刘荭 范万红 江育林 黄倢
根据SVCV糖蛋白基因序列设计引物,在5’引物和3’引物中分别引入酶切位点。以病毒核酸为模板用RT-PCR方法扩增该段糖蛋白基因,将所得的基因片段(517和521)克隆至穿梭载体pGAPZαA/B之GAP启动子下游位点,构建含α信号肽的重组表达载体。获得的重组质粒pGAPZαA-517和pGAPZαB-521经线性化后,电击法转化毕赤酵母SMD1168菌株,构建分泌型表达SVCV糖蛋白的重组酵母菌株。酵母菌落PCR法检测表明,已成功构建分泌表达SVCV糖蛋白的酵母基因工程菌株,斑点印迹法进一步分析表明有目的蛋白的成功表达。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
黄伟坚 姜焱 陈德胜 芦银华 张雪莲 陈溥言
应用PCR方法从PRVSH (上海株 )病毒培养物扩增了gG基因 ,克隆入 pcDNA3质粒 ,并进行了序列测定。结果表明 ,扩增的 gG基因片段长 1719bp ,包含一个 14 91bp的开放阅读框 (ORF) ,在起始密码子上游有TATAAAA盒 ,在终止密码子下游有AATAAA的 poly (A)尾 ,编码由 4 96个氨基酸组成的蛋白质。与Rice株相应的gG片段相比 ,核苷酸序列同源性达 97 1%。但推导的氨基酸序列同源性仅有 87 6 % ,主要是在编码区内插入和缺失核苷酸 ,出现了突变和移码 ,导致氨基酸序列同源性降低。gG具有膜蛋白的结构特点。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
温立斌 何孔旺 杨汉春 倪艳秀 吕立新 张雪寒 茅爱华
根据GenBank中的猪抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增和克隆了PKR、OAS/RNase L及Mx的101 bp核苷酸片段。测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx标准曲线及其直线回归方程;该方法具有线性关系好,特异性、敏感性、重复性高等特点;建立的荧光定量PCR方法可检测抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx mRNA水平。为猪体内抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx的mRNA水平的定量检测提供必要...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王树云 李江宇 高志强 谷强 蒲静 任彤 张伟 张旻 江育林 武勇 张利峰
根据Gen Bank中鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白全基因序列设计特异性引物,以SVCV欧洲株病毒核酸为模板,通过RT-PCR方法获得欧洲株SVCV-G基因,克隆至p PICZαA,构建p PICZαASVCV1540表达质粒。以限制性内切酶Sac I线性化p PICZαASVCV1540后通过化学法转化毕赤酵母感受态细胞X33和GS115,添加1%甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物显示其分子质量为70 ku。Western Blot分析显示该蛋白可以被SVCV山羊多抗识别,表明目的蛋白具有反应原性。
关键词：
鲤春病毒血症病毒 糖蛋白 毕赤酵母
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨宝华 闵永洁 陈溥言 蔡宝祥 王启松
根据已知A抗原基因设计并人工合成了两段寡聚核苷酸片段并进行末端标记作为探针,与pAcyc184 MDV BamHI-B 质粒经过 EcoRI、pvu Ⅱ酶切电泳后作 Southern 转印杂交,其中2.2kb 片段杂交阳性.将此片段与 pBluescript(PBS)载体连接转化 E.coli JM109菌株,经原位杂交、酶切分析鉴定,得到3株 pBSA2.2k 阳性克隆.进一步酶切证明,A 抗原基因存在于此片段中.
关键词：
马立克氏病病毒 A抗原基因 鉴定 亚克隆
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
缪德年 王秀花 姜法铭 陈溥言 樊生超
将马立克氏病病毒(MDV)超强毒株VP22基因插入真核表达载体pEGFP-C1中EGFP基因的下游,构建EGFP-VP22融合基因真核表达载体pEGFP-VP22。将其转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO-k1)中,通过荧光显微镜观察EGFP的表达情况,并用RT-PCR检测VP22基因的表达。检测证实EGFP和VP22在CHO细胞中均得到了有效表达。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
任晓明 古市雅哉 林正信
以鸡马立克氏病脾脏淋巴瘤继代细胞系MDCC MB1(MSB1)为研究对象 ,用southern和northern斑点分子杂交放射自显影等方法 ,证明了 5 氮胞苷可以阻断MSB1细胞DNA的甲基化 ,且去甲基化的DNA转录区和部分非转录区有特异增幅的转录产物mRNA ,说明这些区基因转录活性上升。用 5 氮胞苷处理MSB1细胞使其去甲基化后 ,该细胞DNA的内切酶BamHⅠ区域对DNaseI敏感性增高 ,该片段区的基因表达活性也增高。以上结果提示 ,DNA的去甲基化可以提高MDV的基因表达 ,进一步说明MDVDNA的甲基化在抑制MDV基因表达 ,维持MDV在淋巴瘤细胞株中潜伏感染状态可能起...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张冬峰 郑亚东 骆学农 王晓霞 陈轶霞 李辉 侯俊玲 潘晓梅 刘琼 景志忠 岳城 才学鹏
从甘肃景泰疑似羊痘患病绵羊的皮肤组织中提取基因组DNA,利用PCR技术,克隆糖蛋白orf118基因.比较分析表明,该基因由516个核苷酸组成,编码171个氨基酸,相对分子质量为19500,其碱基组成极不平衡,其中A+T含量占72.48%,G+C含量仅占27.52%.甘肃景泰株orf118基因同绵羊痘病毒TU-V02127株之间的核苷酸同源性最高达99.8%,氨基酸的同源性为100%;与疙瘩皮肤病病毒肯尼亚株和山羊痘病毒G20-LKV株之间的同源性分别为96.5%和94.8%.结构预测结果显示,orf118蛋白为分泌蛋白,具有2个N键连结糖基化位点和1个跨膜区.以上结果表明,orf118蛋白在不...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姜平 陈溥言 蔡宝祥 黄兵
用传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２、ＶＰ３重组质粒ＤＮＡ及其大肠杆菌表达产物全菌裂解液油乳剂苗肌肉注射１４日龄仔鸡，免疫后１４和２１ｄ测定血清ＥＬＩＳＡ抗体效价，并于免疫后２１ｄ用ＩＢＤＶ南京野毒株攻击。结果显示：（１）ＶＰ２基因重组质粒ＤＮＡ除可诱导产生较高的ＥＬＩＳＡ抗体外，还可明显降低仔鸡ＩＢＤＶ攻击所引起的急性发病率和死亡率；（２）ＶＰ３－ＧＳＴ融合蛋白表达产物全菌裂解液可较早地诱导产生ＥＬＩＳＡ抗体，但对ＩＢＤＶ野毒株攻击只提供部分保护；（３）ＶＰ２和ＶＰ３表达产物无明显协同作用。
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