- 年份
- 2024(7901)
- 2023(11262)
- 2022(9124)
- 2021(8289)
- 2020(7243)
- 2019(16165)
- 2018(16532)
- 2017(30970)
- 2016(17803)
- 2015(20488)
- 2014(21035)
- 2013(20426)
- 2012(19086)
- 2011(17040)
- 2010(17363)
- 2009(16239)
- 2008(16340)
- 2007(15269)
- 2006(13330)
- 2005(12058)
- 学科
- 济(68695)
- 经济(68611)
- 管理(48309)
- 业(44820)
- 企(35547)
- 企业(35547)
- 方法(29722)
- 数学(25521)
- 数学方法(25241)
- 农(21682)
- 中国(20823)
- 财(18491)
- 学(18481)
- 业经(15776)
- 制(15734)
- 地方(14521)
- 农业(13994)
- 理论(12075)
- 贸(12064)
- 贸易(12059)
- 银(12052)
- 银行(11989)
- 体(11961)
- 易(11669)
- 行(11403)
- 和(11224)
- 融(11214)
- 金融(11206)
- 务(11024)
- 财务(10986)
- 机构
- 大学(258114)
- 学院(257722)
- 济(97010)
- 经济(94657)
- 研究(92266)
- 管理(90810)
- 理学(77330)
- 理学院(76345)
- 管理学(74542)
- 管理学院(74092)
- 中国(69200)
- 科学(61934)
- 农(57467)
- 京(56483)
- 所(49963)
- 财(46549)
- 业大(45790)
- 农业(45672)
- 研究所(45560)
- 中心(42426)
- 江(41959)
- 财经(36079)
- 北京(35130)
- 范(34616)
- 师范(34101)
- 院(33002)
- 州(32867)
- 经(32534)
- 技术(31698)
- 省(31544)
- 基金
- 项目(170894)
- 科学(131119)
- 基金(120306)
- 研究(119757)
- 家(107640)
- 国家(106742)
- 科学基金(88608)
- 社会(72202)
- 省(69594)
- 社会科(68080)
- 社会科学(68053)
- 基金项目(63439)
- 自然(58717)
- 划(58383)
- 自然科(57339)
- 自然科学(57317)
- 自然科学基金(56263)
- 教育(56088)
- 编号(49633)
- 资助(49169)
- 成果(41761)
- 重点(39529)
- 发(37156)
- 部(36347)
- 课题(35576)
- 创(34857)
- 计划(33702)
- 科研(33187)
- 创新(32700)
- 大学(30852)
- 期刊
- 济(110385)
- 经济(110385)
- 研究(72532)
- 中国(56908)
- 农(53840)
- 学报(53000)
- 科学(43554)
- 大学(38516)
- 财(38185)
- 学学(36487)
- 农业(35858)
- 管理(32382)
- 教育(31240)
- 融(23531)
- 金融(23531)
- 技术(22533)
- 业经(19169)
- 业(18978)
- 财经(17957)
- 经济研究(17565)
- 版(15633)
- 经(15424)
- 问题(15237)
- 业大(14733)
- 图书(13481)
- 科技(12918)
- 农业大学(12530)
- 技术经济(12146)
- 理论(11729)
- 统计(11729)
共检索到391401条记录
发布时间倒序
- 发布时间倒序
- 相关度优先
文献计量分析
- 结果分析(前20)
- 结果分析(前50)
- 结果分析(前100)
- 结果分析(前200)
- 结果分析(前500)
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘京国 赵晓萌 杨爱珍 师光禄
【目的】构建含有α-胰凝乳蛋白酶作用位点的Cry3A的突变体Cry3Am,以期提高Cry3A的活化效率,增强杀虫活性。【方法】利用重叠PCR技术,构建Cry3A杀虫蛋白的突变体Cry3Am,使之在原核细胞中表达纯化突变体蛋白;将Cry3Am与饲料混合后饲喂黄粉虫,用以评价Cry3Am的杀虫活性。【结果】成功地在Cry3A杀虫蛋白结构域I的α3和α4之间加上1个α-胰凝乳蛋白酶的作用位点,并提取Cry3Am到杀虫蛋白。体外酶切试验结果表明,Cry3Am很容易地被降解为55 kD的杀虫蛋白。生测分析结果表明,Cry3Am对黄粉虫的毒力是Cry3A的2倍以上。【结论】向Cry3A中插入α-胰凝乳蛋白...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张小琼 林拥军
以改造合成的5个Bt基因(cry1C*、cry2A*、cry1Ab、cry1Ac和cry9C*)为材料,利用DNAshuff-ling的体外分子进化技术构建1个含有1 000个重组基因克隆的大肠杆菌表达库;通过诱导表达重组蛋白,ELISA方法测定蛋白表达量,以棉铃虫(Helicoverpa armigera)为试验昆虫进行毒性试验。结果显示:重组克隆的蛋白毒性与阳性对照Cry1Ac相比,增强的有122个,持平的有38个,有毒性但毒性降低的有232个,失去毒性的有608个;对这1 000个重组克隆进行了测序,比较了重组基因与原始基因的序列同源性,除去55个克隆未能找到其原始基因来源,将其余的94...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
牛传双 方六荣 肖少波 张辉 陈焕春
增强型绿荧光蛋白突变体mut4EGFP(EGFP/V16 3A/S175G)是一种发光能力更强、更稳定的新型绿色荧光蛋白。为了获得大量高纯度的蛋白 ,将mut4EGFP基因插入原核表达载体 pTWIN1中 ,使之与几丁质结合域 (CBD) 内含肽 (intein)融合 ,获得原核表达质粒 pTWIN M 4。将 pTWIN M 4转化大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS ,IPTG诱导后进行SDS PAGE电泳分析 ,结果显示 ,CBD intein mut4EGFP融合蛋白在BL2 1(DE3) plysS中获得高效表达并以可溶性蛋白的形式存在。进一步采用几丁质柱纯化系统对表达产物进行纯...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨海 王芳宇 李青旺 胡建宏 董潇潇 单永红
【目的】建立一种对人抗凝血酶(AT)Cys248位点进行定点突变和真核表达的可靠方法,为突变体的结构和功能研究提供原始材料。【方法】以人AT cDNA序列为模板,设计1对反向扩增引物,进行反向PCR反应;PCR产物经连接、测序后,克隆至表达质粒pcDNA3.1(+)-GFP上,构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-mATGFP;用重组载体介导突变基因在山羊乳腺上皮(GME)细胞内表达,收集细胞培养上清液进行表达产物的定性、定量检测。【结果】突变基因经测序证实与预期结果一致,且在GME细胞内得到高效表达,细胞培养液上清中的突变体质量浓度为(526±17.3)mg/L。【结论】反向PCR法是...
[期刊] 华北农学报
[作者]
臧大康 郑桂玲 周洪旭 张媛 李国勋 李长友
以本实验室分离的Bt菌株B-DLL质粒DNA为模板,利用cry8类基因特异性引物JJX5和JJX3扩增出3.5kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD 18-T中,筛选获得一个含新基因的克隆pMD-cry8new。序列测定表明,该基因编码区为3 525 bp,编码的蛋白质由1 174个氨基酸残基组成,理论分子量为133.05 kDa,等电点为pH4.69,为弱酸性蛋白。该基因核苷酸序列已在GenBank登录(Accession number:HQ174208),编码的氨基酸序列与Cry8Fa1的同源性最高达99.8%,被国际Btδ-内毒素命名委员会正式命名为Cry8Fa2。将cry8Fa2基因插...
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘兴龙 程林友 李天龙 李长友 李国勋
根据已知Btcry8类基因的全长序列设计一对特异性引物JJX5和JJX3,以Bt菌株B-DLL的质粒DNA为模板扩增出3.5 kb大小的片段;将该片段插入大肠杆菌表达载体pET-21b中,并完成了该片段的全序列测定。该基因编码区为3 495 bp,编码的蛋白质由1 164个氨基酸残基组成,相对分子质量为131.8 kDa,等电点为pH 4.71,为弱酸性蛋白。该基因(GenBank:EU047597)编码的氨基酸序列与Cry8Ea1的氨基酸序列同源性高达99.31%,被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry8Ea2。经IPTG诱导后该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达130 kDa...
[期刊] 水产学报
[作者]
于克锋 袁春红 陈舜胜 王锡昌 今野久仁彦
以夏季和冬季鲢为研究对象,利用胰凝乳蛋白酶能水解羧基端含芳香族氨基酸残基肽键的特性,根据其特异性酶切部位,结合电泳手段来分析肌球蛋白的内部构造差异性。结果表明,与夏季样品相比,冬季鲢的肌原纤维蛋白经酶切生成的肌球蛋白头部S-1较长,在高温下分子量为165 ku的重酶解肌球蛋白HMM容易被再降解成小片段的135 ku HMM,呈现出冬季肌球蛋白的结构不稳定性。在不同温度下加热夏季和冬季肌球蛋白,其ATPase失活速度和酶解肌球蛋白生成S-1的产生量的减少速度呈现一致性,说明酶解生成的S-1只来源于有活性的肌球蛋白。同时,冬季肌球蛋白热变性温度较夏季肌球蛋白要低6℃,表明冬季肌球蛋白的不稳定性。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
李传阳 许淼洋 THAMMARATSUNTORN Jeerawat 赵金良 钱叶洲 吴超 钱德
为了解不同种类鳜鱼生长差异的生理基础与机制，比较研究了鳜（Ｓｉｎｉｐｅｒｃａ ｃｈｕａｔＳｉ）、斑鳜（Ｓｉｎｉｐｅｒｃａ．Ｓｃｈｅｒｚｅｒｉ）和杂交鳜（斑鳜♀×鳜♂）幼鱼３０ ｄ内的生长速率与日摄食量、胃蛋白酶活性和胃蛋白酶原（ｐＧａ１、ｐＧａ２、ｐＧｃ）基因相对表达量间的关系。结果表明，鳜、杂交鳜和斑鳜日增重率分别为（１．１７１±０．１８０）Ｇ／ｄ、（１．０１９±０．１０４）Ｇ／ｄ和（０．４３３±０．０７８）Ｇ／ｄ，生长速率快慢次序是鳜＞杂交鳜＞斑鳜。鳜、杂交鳜和斑鳜平均日摄食量分别为（６．１±０．３１）Ｇ／ｄ、（５．２６±０．３３）Ｇ／ｄ、（４．２４±０．２３）Ｇ／ｄ。胃蛋白酶比活力最高部．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李树红 陈志光 李冉 李新 李松 陈秀华 蒋然然 李美良 马璐阳
对原核表达的重组建鲤组织蛋白酶L(Cathepsin L,CAT L)蛋白进行尿素洗涤和Ni-NTA亲和层析纯化,该目的蛋白经300 mmol/L咪唑洗脱为单一峰,SDS-PAGE结合TSK-GEL G2000SWxl凝胶过滤高效液相色谱分析表明重组CAT L获得了高度纯化,分子量约28 k D,纯度超过95%。Z-Phe-Arg-MCA底物测活法显示该重组CAT L表现为半胱氨酸蛋白酶活性,能与其内源抑制因子Cystatin以1︰1的摩尔比结合,具有生物学活性。以纯化的重组CAT L蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗血清,经ELISA法检测获得的CAT L抗血清效价高于1︰512000;West...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张宇飞 曹满园 王丽英 赵伟刚 李晓霞 常彤 许保增
【目的】体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的cDNA全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源。进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近。经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA。免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质。Western blot结果显示激活素A的前体蛋白分子量约为58 kD左右。镍亲和层析纯化后的激活素A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素A可以激活SMAD信号通路。同时成熟的激活素A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterolside-chaincleavageenzyme,CYP11A1orP450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变。结果表明梅花鹿激活素A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用。【结论】成功构建了激活素A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素A重组蛋白,为下一步激活素A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
崔少勃 丁鲜 张峰
[目的]本文旨在通过建立棉铃虫效应蛋白HARP1体外表达纯化体系，对HARP1蛋白进行体外表达和纯化，为解析HARP1蛋白与植物茉莉酸信号途径中JAZ蛋白的互作分子机制奠定基础。[方法]对harp1基因序列进行密码子优化，使用蛋白预测软件预测HARP1中的信号肽和成熟肽。基于以上信息构建目的蛋白的表达质粒并进行诱导表达，使用亲和层析、酶切、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对目的蛋白进行纯化，使用SDS-PAGE和Western blot对蛋白进行分析和检测。[结果]通过优化将harp1基因密码子适应度值(CAI)从0.39提升到0.95。蛋白预测软件预测N末端21个氨基酸为信号肽，信号肽与成熟肽切割位点在第21位丙氨酸和第22位亮氨酸之间，成熟肽为第22位亮氨酸至第122位精氨酸。构建表达质粒pETDuet1-His6-MBP-3C-HARP1(22～122),IPTG能够诱导目的蛋白表达，使用Ni-NTA柱纯化出融合蛋白His6-MBP-3C-HARP1(22～122),3C蛋白酶能够切除His6-MBP标签，使用阴离子交换柱成功分离His6-MBP标签和HARP1(22～122)蛋白，使用Superdex 200 increase Gel Filtration Column进一步纯化获得单体HARP1(22～122)蛋白。[结论]成功建立HARP1蛋白体外表达与纯化体系。
关键词：
棉铃虫 效应蛋白 HARP1 表达 纯化
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
崔少勃 丁鲜 张峰
[目的]本文旨在通过建立棉铃虫效应蛋白HARP1体外表达纯化体系，对HARP1蛋白进行体外表达和纯化，为解析HARP1蛋白与植物茉莉酸信号途径中JAZ蛋白的互作分子机理奠定基础。[方法]对harp1基因序列进行密码子优化，使用蛋白预测软件预测HARP1中的信号肽和成熟肽。基于以上信息构建目的蛋白的表达质粒并进行诱导表达，使用亲和层析、酶切、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析等多种手段对目的蛋白进行纯化。使用SDS-PAGE和Western blot对蛋白进行分析和检测。[结果]通过优化将harp1基因密码子适应度值（CAI）从0.39提升到0.95。蛋白预测软件预测N末端21个氨基酸为信号肽，信号肽与成熟肽切割位点在第21位丙氨酸和第22位亮氨酸之间，成熟肽为第22位亮氨酸至第122位精氨酸。构建表达质粒pETDuet1-His6-MBP-3C-HARP1(22-122)，IPTG能够诱导目的蛋白表达，使用Ni-NTA柱纯化出融合蛋白His6-MBP-3C-HARP1(22-122)，3C蛋白酶能够切除His6-MBP标签，使用阴离子交换柱成功分离His6-MBP标签和HARP1(22-122)蛋白，使用Superdex 200 increase Gel Filtration Column进一步纯化获得单体HARP1(22-122)蛋白。[结论]成功建立HARP1蛋白体外表达与纯化体系。
关键词：
棉铃虫 效应蛋白 HARP1 表达 纯化
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈倩 杨尚谕 卓维 李佳皓 彭双 王静 李立芹
为了研究烟草中蛋白激酶CIPK3在植物非生物胁迫应答中的功能,通过同源克隆的方法,在普通烟草品种K326中克隆到1个CIPK家族基因NtCIPK3。利用生物信息学软件对该基因编码蛋白的结构和功能进行了预测分析。该基因包含一个1 272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸残基。蛋白序列分析表明,该蛋白含有一个跨膜结构域,且平均疏水性系数小于0,属于亲水性膜蛋白。蛋白比对分析发现,NtCIPK3含有高度保守的N端激酶区、连接区以及C端调控区,与野生烟草CIPK3的同源性最高,达99%。亚细胞定位预测显示,该蛋白主要定位于细胞核,且具有双分型的核定位信号序列。运用qRT-PCR技术,对该基因的表达特性进行了分析,组织表达分析发现,该基因在烟草的根、茎、叶、花中均有表达,但在叶中表达水平明显高于其他组织,推测可能主要在叶中行使功能。NtCIPK3基因在不同程度上受低钾、高盐、干旱、ABA、H_2O_2、低温处理的诱导,推测NtCIPK3基因在烟草的非生物胁迫应答反应中发挥了重要作用。并成功构建pBI121-NtCIPK3过表达载体,为今后该基因在非生物胁迫下的功能研究奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王育伟 彭正松 杨在君 魏淑红 廖明莉 赵欢 杨会 杨宇凤 王清海
为探讨Ta AP1-3基因在小麦三雌蕊性状形成中的作用,从小麦三雌蕊近等基因系CM28和CM28TP中克隆得到3个同源基因Ta AP1-3a、Ta AP1-3b和Ta AP1-3c。通过碱基序列、氨基酸序列、聚类及实时荧光定量分析表明,TaAP1-3a、Ta AP1-3b和Ta AP1-3c基因c DNA序列分别为1 210,1 208,1 199 bp,ORF分别为825,816,855 bp,分别编码274,271,284个氨基酸残基。Ta AP1-3a、Ta AP1-3b和Ta AP1-3c与中国春Ta AP1-3的核苷酸序列相似度分别为96.02%,93.1%,93.56%,氨基酸序列...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵艳 孙天国 王慧 张梅娟 崔巍 沙伟
【目的】克隆大豆天冬氨酸蛋白酶基因(soyAP1)启动子,并对其表达方式及活性进行分析。【方法】利用TAIL-PCR方法从大豆基因组DNA中克隆soyAP1基因启动子片段。利用启动子在线预测工具分析soyAP1基因启动子片段的启动子元件,并用克隆得到的SAP片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SAP。通过农杆菌介导法,使其在大豆各组织中进行瞬时表达,用GUS组织化学染色法分析SAP在各组织中的表达活性。【结果】克隆获得了大豆soyAP1基因的启动子片段,长1 650bp,并将之命名为SAP,其转录起始位点可能是553bp处的A;PLACE分析表明,SA...
文献操作()
导出元数据
文献计量分析
导出文件格式：WXtxt
删除
