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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
方六荣 牛传双 肖少波 余晓岚 陈桦 陈焕春
以地高辛标记的伪狂犬病毒 (PRV)Ea株UL4 9.5基因片段为探针 ,同SalI、KpnI、BamHI消化的PRVEa株基因组DNA进行Southern杂交 ,确定SalI 2 .8kb、KpnI 17.0kb、BamHI 2 5 .0kb片段中含UL4 9基因。将SalI2 .8kb片段克隆到pUC119中 ,利用其中的BamHI进行亚克隆 ,获得重组质粒pUC2 .0。测定约 2 .0kb片段的全序列并进行序列分析 ,发现该片段包含UL5 0基因部分编码区 ,UL4 9.5基因和UL4 9基因的完整编码区 ,并且在UL4 9基因下游 ,还存在一段约 36 9个碱基的序列 ,经与人单纯疱...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
方六荣 陈焕春 肖少波 徐引娣 何启盖
根据伪狂犬病病毒国外Ka株UL5 4基因核苷酸序列 ,设计一对包含UL5 4基因完整编码区的引物 ,以伪狂犬病病毒国内地方分离株Ea株细胞感染物为模板 ,PCR扩增出大小约 1.1kb特异性带。将纯化的扩增产物克隆到pBluescriptⅡsk +中 ,酶切分析证实后经双脱氧末端终止法进行全序列测定 ,序列分析结果表明Ea株UL5 4基因全长 10 86bp ,可编码 36 1个氨基酸。由二级结构预测数据推断C 末端具有典型的锌指结构域。运用Blast软件与Ka株UL5 4基因进行同源比较 ,发现Ea株UL5 4基因在核苷酸和氨基酸水平上均存在多处点突变 ,但无插入或缺失突变 ;将Ea株UL5...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
黄伟坚 姜焱 陈德胜 芦银华 张雪莲 陈溥言
应用PCR方法从PRVSH (上海株 )病毒培养物扩增了gG基因 ,克隆入 pcDNA3质粒 ,并进行了序列测定。结果表明 ,扩增的 gG基因片段长 1719bp ,包含一个 14 91bp的开放阅读框 (ORF) ,在起始密码子上游有TATAAAA盒 ,在终止密码子下游有AATAAA的 poly (A)尾 ,编码由 4 96个氨基酸组成的蛋白质。与Rice株相应的gG片段相比 ,核苷酸序列同源性达 97 1%。但推导的氨基酸序列同源性仅有 87 6 % ,主要是在编码区内插入和缺失核苷酸 ,出现了突变和移码 ,导致氨基酸序列同源性降低。gG具有膜蛋白的结构特点。
[期刊] 华北农学报
[作者]
高晓云 顾阳 潘鑫龙 郭小参 崔保安 陈红英
为了确定河南部分地区按照正常免疫程序接种猪伪狂犬病病毒(PRV)基因缺失苗的猪场是否发生了PRV野毒感染,了解新流行株的主要毒力基因g E是否发生变异,利用PCR方法,对南阳、周口、巩义、济源、漯河、原阳等地采集的疑似PRV感染的病料进行检测。对PCR检测为阳性的病料接种猪睾丸细胞,传至6代,分离出9株PRV,克隆其g E全基因并进行序列分析。结果表明,9株PRV均能扩增出1 862 bp的g E基因,且彼此之间同源性为99.9%~100%,与其他PRV毒株同源性为97.5%~99.6%。9株分离株处于一大分支上,且均含有2个氨基酸插入,在448位和510位均发生氨基酸置换。结果表明,分离株均...
关键词：
猪伪狂犬病毒 g E基因 克隆 序列分析
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
曾显成 吴异健 陈家祥 姚金水 吴宝成
采集福州郊区病仔猪的鼻腔黏液、脑、脾脏、肾脏、淋巴结等组织病料,研磨上清接种到非洲绿猴肾(Vero)细胞和狗肾(MDCK)细胞进行病毒分离,通过对分离病毒株进行形态学、血清学、荧光抗体试验、动物接种试验、PCR试验等鉴定,确定所分离的病毒为猪伪狂犬病病毒(PRV),命名为PRV-FZ株.根据GenBank收录的PRV gD基因的序列设计一对引物,通过PCR方法扩增出约1579 bp的目的片段,并将其克隆到PCAGGS载体进行酶切鉴定、核苷酸序列测定和分析.结果表明,目的片段包含一个1203 bp的开放阅读框,编码400个氨基酸组成的多肽,与GenBank中有代表性的5株参考毒株相应基因序列比较...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
冉智光 童光志 张绍杰 王玉春 黄勇富
根据已发表的伪狂犬病毒（ＰｒＶ）的基因序列，在ＰｒＶｇＥ基因起始密码子和终止密码子的上、下游分别设计一对引物ＰＣＬ１和ＰＣＬ２，在ＰＣＬ１和ＰＣＬ２的５端分别加上ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ位点，以ＰｒＶＭｉｎ－Ａ株ＤＮＡ为模板成功地扩增到约１．８ｋｂ的片段，经酶切鉴定为ＰｒＶｇＥ基因。将此ＰＣＲ产物以ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ消化，回收后与经ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ酶解的ｐＵＣ１１９连接、转化，获得了明显大于载体的重组质粒，经限制性酶切和序列部分测定鉴定了阳性重组质粒ｐＲＺＥ。将ｐＲＺＥ分别经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ酶切，回收ｇＥ基因，分别克隆到真核表达载体ｐＣＲ３－Ｕｎｉ和杆状病毒载体...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
于春梅 李鹏 郑其升 李斐 苏鑫铭 曹瑞兵 周斌 陈溥言
为了给伪狂犬病病毒(PrV)UL24蛋白的细胞定位和功能研究提供参考依据,据GenBank公布的PrVUL24基因序列(登录号NC006151)设计1对引物,以质粒pUL24-GFP为模板,用PCR方法扩增出部分缺失的基因片段mUL24(modified UL24)。将mUL24片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达载体pET-UL24。阳性质粒转化宿主菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白(His)6-UL24以包涵体的形式获得表达。用纯化后的pET-UL24融合蛋白免疫家兔,ELISA分析表明,在血清效价达到1∶2 560以上,Western-b...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
汪铭书 郭万柱 娄高明 费恩阁 宣华
以质粒pBR322 作载体, 用鸟枪法克隆出了PRV 闽A 株除Bam HI-1,BamHI-2外的所有酶切片段,构建了PRV闽4株基因文库,并以克隆出的Bam HⅠ片段用光生物素标记作探针, 应用分子杂交法确定PRV闽A株绝大部分限制内切酶位点的位置。
关键词：
伪狂犬病毒 基因文库 物理图谱
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
汪招雄 何启盖 黄红亮 刘正飞 陈焕春
将伪狂犬病毒Ea株纯化后免疫雌性Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/O的骨髓瘤细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)进行筛选,获得了2株抗PRV的单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3G7E3和4A6F5,其细胞培养上清及小鼠腹水效价(ELISA)分别为1:212、1:212及1:100×212、1:100×212。特异性试验和免疫荧光结果显示,3G7E3和4A6F5仅与PRV反应,而与PPV、PRRSV、JEV和HCV等病毒不发生交叉反应;用单抗建立的夹心ELISA试验能检出伪狂犬病毒。表明本研究所获得的2株单抗是PRV特异性的。这2株分泌抗PRV单抗的杂交瘤细胞株的获得为进一步建立...
[期刊] 华北农学报
[作者]
吕蔚 李潭清 韩新影 康亚男 杨润德
用纯化的猪伪狂犬病病毒闽A株(PRV-FA)免疫Balb/c鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA筛选,获得2株能稳定分泌伪狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4G9E9和4H9C9。这2株杂交瘤细胞株细胞培养上清和小鼠腹水效价(ELISA)分别为1∶6400、1∶12800及1∶12800、1∶25600。特异性鉴定结果表明,各株单抗均不与猪瘟病毒、乙脑病毒、猪呼吸繁殖障碍综合症病毒、猪细小病毒等发生交叉反应,这2株抗PRV杂交瘤细胞株的获得为进一步建立准确快速的抗原检测方法奠定了基础。
关键词：
伪狂犬病病毒 单克隆抗体 制备
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
缪德年 王秀花 封江南 姚惠娟 吴琼杉 樊生超 陈溥言
以马立克氏病病毒超强毒(RB1B株)UL49为靶基因,利用计算机辅助设计UL49基因特异的siRNA,再定向克隆至pSilencerTM2.1U6neovector载体中构建siRNA表达重组体,转化DH5α菌株,提取质粒酶切鉴定后,进行测序分析,证实为所需序列。以上结果表明,针对马立克氏病超强毒UL49基因的siRNA表达质粒已构建成功。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
乔军 夏咸柱 胡桂学 谢之景 闫芳 杨松涛 黄耕
根据GenBank中报道的CCVInsavc 1株核蛋白基因(M)序列,用特异性引物对分离的CCVV1野毒株进行了RT PCR扩增,将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM T连接得到重组质粒pTM,并进行了核苷酸序列测定。结果表明,该基因全长为789bp,编码263个氨基酸,其中前17个氨基酸为信号肽。与CCV标准毒株Insavc 1M基因相比,两者核苷酸的同源性为92.1%;推导的氨基酸序列同源性为90.9%,差异主要发生在该蛋白的N端前1/3区域内。在推导的M蛋白氨基酸序列中,发现了3个明显的疏水区,提示该蛋白可能是一个反复跨膜的蛋白;在N端15～17,38～40,234～236位氨基酸...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姜焱 张常印 黄伟坚 陈溥言
在伪狂犬病病毒 (PRV)上海株gI和gE基因克隆鉴定的基础上 ,用BamHⅠ +BstpⅠ去掉gE基因的 5′端 36 3bp ,在缺失位置插入绿色荧光蛋白 (GFP)和LacZ基因 ,构建含双报告基因的PRV SH转移载体pgEI GFPZ。将pgEI GFPZ转染PRV SH的BHK 2 1细胞 ,待出现 80 %病变后收获病毒 ,并以蚀斑法得到纯化的含LacZ和GFP两种筛选标记的缺失了gE/gI的重组病毒株
[期刊] 华北农学报
[作者]
蒋素华 梁芳 王洁琼 李艳辉 王默霏 崔波
为了给筛选萼脊兰内参基因和研究TUB基因的生理功能提供研究基础,对萼脊兰TUB基因片段进行克隆与序列分析。采用CTAB法提取萼脊兰盛花期花瓣总RNA,并运用RT-PCR方法克隆萼脊兰TUB基因序列,长度为1 055 bp,编码351个氨基酸残基,氨基酸序列中存在微管蛋白的保守区域GGGTGSG。序列分析结果表明:与其他已登录物种的TUB基因相比,其核苷酸序列的同源性达75%~96%,与朵丽蝶兰(JN185665.1)同源性高达96%,氨基酸序列的同源性也在96%以上,且与单子叶植物的同源序列表现出较高的相似性。在Gen Bank注册,登录号为KP686397。
关键词：
萼脊兰 TUB基因 克隆 序列分析
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李学伍 陈焕春 吴斌 金梅林 方六荣
对两株伪狂犬病毒在４、２８、３７℃下进行血凝试验（ＨＡ）和血凝抑制试验（ＨＩ）。试验结果表明，伪狂犬病毒能够凝集小白鼠红血球，ＨＡ可被抗伪狂犬病毒的高免血清特异性抑制（１：６４）。并不受温度的影响。因此，该方法是诊断伪犬病的一种快速、简便、易于推广的方法。
关键词：
血凝试验,血凝抑制试验,伪狂犬病毒
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