【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、AsiaI型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA)。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、AsiaI型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72and AsiaⅠ/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒。【结果】本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104LD50(1﹕128倍稀释乳鼠毒)的病毒量。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性...

为了建立一种快速、简便的检测鸡新城疫病毒(NDV)的胶体金免疫层析法(GICA),采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的ND抗体,并包被在玻璃纤维素膜上,另外将纯化的ND抗体和纯化的兔抗鸡抗体包被在硝酸纤维素膜上,组装成ND快速检测试纸条.用本试验研制的ND快速检测试纸条检测收集的24份样品,其结果与HA结果一致,符合率100%;当病毒HA效价在1∶40以上时,试纸条均能检测为阳性;ND快速检测试纸条与已知的马立克病(MD)病料和鸡传染性法氏囊病(IBD)病料的上清液无交叉反应出现,且保存6个月后重复性100%.试验证明,建立的GICA是一种快速、灵敏、特异的抗原检测方法,可用于鸡新城疫...

【背景】口蹄疫（foot and mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、烈性传染病，疫苗接种是预防临床口蹄疫的有效措施。免疫抗体水平监测则是评估疫苗免疫效果、制定免疫程序的重要依据，是免疫工作和疫情防控必不可少的关键环节，因此建立高效、快速、全自动的抗体检测方法具有重要意义。【目的】基于磁微粒（micromagnetic particles,MPs）化学发光免疫分析技术（CLIA），建立一种新型、全自动、可定量的口蹄疫病毒O型抗体检测方法，为口蹄疫免疫监测和疫情防控提供技术支撑。【方法】使用纳米材料磁微粒为固相载体和分离载体包被捕获抗体，用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）标记检测抗体，经过条件优化建立了一种新型磁微粒CLIA检测方法(magnetic particle chemiluminescence immunoassay,MP-CLIA)。本方法首先加入磁微粒-兔抗偶联物(magnetic particle-polyclonal antibodies,MPs-p Abs)、待测样本、口蹄疫病毒O型抗原，37℃孵育；再加入适量酶标抗体（ALP-p Abs),37℃孵育；最后加入化学发光底物AMPPD，检测相对发光强度（relative light unit,RLU）。研究通过检测标准品拟合标准曲线，并应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic,ROC）确定检测方法的判定标准；利用质控样本进行方法学评价，同时检测田间样本，并和液相阻断ELISA(LPB-ELISA）比对，验证临床检测效果。【结果】优化后最佳反应条件为磁微粒浓度0.25 mg·m L~(-1)、口蹄疫病毒O型抗原1﹕1 000稀释、酶标抗体1﹕2 000稀释、加样量20μL。整个检测过程均在全自动化学发光免疫分析仪中完成，反应时间20 min，在抗体含量0—1 280 U(效价0—1﹕2 048)范围内标准曲线R ~2>0.99，可进行定量检测。该方法敏感性为94.66%；特异性为97.10%，检测口蹄疫A型、Asia I型血清型特异性为97.14%，与塞内卡病毒（SVV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、牛流行热病毒（BEFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、羊痘病毒（QRFV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）抗体阳性血清无交叉反应；重复检测变异系数CV值<10%；田间样本检测结果与LPB-ELISA符合率为94.69%，定量结果相关系数R ~2为0.8473,P<0.0001，相关性显著。【结论】建立的MP-CLIA方法耗时短、操作简便，配套国产全自动化学发光仪，可进行全自动化检测，是一种新型、高效的口蹄疫病毒O型抗体定量检测方法，本方法对应的试剂盒已经完成中试生产和临床检测试验，在全国不同区域试用效果较好，具有较高的临床应用价值。

【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDVAsia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经NotI线化后和表达T7RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行病毒体内拯救的研究。【结果】转染细胞盲传第3代48h后出现致细胞病变(CPE),第4代10h出现典型的CPE。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的FMDV,而且存在分子标签,表明构建的FMDV全长cDNA分子克隆在BHK-21细胞内成功包装出FMDV。拯救毒与亲本毒...

将从Genbank中提出的20株O型FMDV的全基因组分割成12个编码区域,即Lab、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。通过方差分析,12个编码序列的相对变异率之间无差异(P>0.05);而这12种编码序列所对应的氨基酸相对突变率之间差异显著(P<0.01)。利用Duncan法对这12种氨基酸序列相对突变率进行多重比较,发现3A蛋白的氨基酸相对突变率比其余11种蛋白的差异都显著(P<0.05);VP2、Lpro的氨基酸相对突变率与VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间存在差异(P<0.05);而VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间无差异...

[目的]验证利用革兰氏阳性增强基质颗粒(GEM)浓缩纯化口蹄疫病毒(FMDV)抗原的可行性。[方法]将含有3个自溶素基序的锚钩蛋白基因(PA)与针对O型口蹄疫病毒特异性纳米抗体基因(VHH)串联克隆入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建原核表达载体p ET-VPA,将其转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3),表达获得融合重组蛋白VPA。先将GEM颗粒与重组蛋白VPA在37℃孵育30 min,离心,取沉淀用适量的FMDV抗原液重悬,再经一步低速离心,获得沉淀即为浓缩纯化的口蹄疫病毒抗原。利用SDS-PA

构建共表达O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白前体P12A和蛋白酶3C的重组杆状病毒,为进一步研究FMDV空衣壳抗原和基因工程亚单位疫苗奠定基础。从质粒T-OP1中扩增出编码O型FM-DV衣壳蛋白前体的P12A基因,并将其插入到杆状病毒转移载体pFastDual-3C的PH启动子之下,构建重组杆状病毒转移载体pD-P12A3C。通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒B-P12A3C,转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒。重组杆状病毒经增殖并感染Sf9细胞后,通过双抗体夹心ELISA方法及间接免疫荧光来检测目的蛋白的表...

为实现甲壳类水产品主要过敏原的快速检测，实验使用凡纳滨对虾原肌球蛋白（TM）作为检测靶标，构建了胶体金免疫层析检测方法。使用天然TM分别免疫SD大鼠和新西兰大白兔制备多克隆抗体，以40 nm胶体金标记的鼠多抗作为检测抗体，以兔多抗为捕获抗体，基于双抗体夹心原理组装免疫层析试纸条，并应用于市售食物样品的检测。结果表明，组建的免疫层析试纸条可在5 min之内显示结果，视觉检出限为10 ng/mL，对虾、蟹、克氏原螯虾及美洲螯龙虾等甲壳类水产品的特异性高，但与蛤蜊、扇贝存在微弱的交叉反应；在不含甲壳类水产品的市售食品中的加标回收率为81%～126%，准确性良好；试纸条的批内、批间变异系数低于15%，市售实际食物样品的检测结果与食物过敏原标签一致。研究表明，该方法具有高灵敏度与检测特异性，可在多种基质与商业化食物样品中实现甲壳类过敏原的有效检测，具有较强的实际应用价值。

[目的] 本文旨在建立一种胶体金免疫层析技术高通量测定猪肉、鸡肉组织中8种磺胺类、3种四环素类、2种喹诺酮类和甲氧苄啶药物残留的方法。[方法] 动物肌肉组织中磺胺类、四环素类、喹诺酮类和甲氧苄啶经磷酸缓冲液提取，并经含Tween 20的磷酸缓冲液稀释后，与胶体金标记的单克隆抗体结合，抑制抗体和硝酸纤维素膜检测线（T线）上的抗原结合，从而导致T线颜色变化。通过比较T线和质控线（C线）颜色深浅，对试样中多兽药残留进行定性判定。[结果] 本试验了优化pH值、抗体添加量、抗原包被量、Tween 20添加量和冻干保护剂种类等关键因素，磺胺类、四环素类、喹诺酮类和甲氧苄啶等药物的检出限分别为50、100、50、35 μg·kg~(-1)，灵敏度≥97%，假阳性率≤2%，假阴性率≤3%，且与现有标准方法检测结果一致。[结论] 该方法操作简便，灵敏度和准确度高，检测时间短且稳定性好，可用于动物肌肉组织中多兽药残留的高通量快速检测。

采用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体分泌细胞株,获取抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体,柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒,选择直径20 nm的胶体金颗粒,标记抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体并制备胶体金垫。将胶体金垫与喷涂有抗豚鼠气单胞菌兔多克隆抗体和羊抗鼠抗体的硝酸纤维素膜及样品吸收垫等组装成免疫层析试纸条,建立豚鼠气单胞菌的快速检测方法。用灭活细菌与血清混合的模拟样本测定试纸条的特异性、灵敏度,结果显示,试纸条对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌等13种常见病原菌没有交叉反应,与豚鼠气单胞菌显示特异性反应,检测灵敏度为1×106CFU/mL,结果显示时间小...

[目的]建立用于快速检测伏马菌素B1(FB1)的胶体金免疫层析试纸条。[方法]首先制备了FB1单克隆抗体和FB1-OVA偶联抗原,然后将FB1单克隆抗体与胶体金制成金标抗体包被在金标垫上,将FB1-OVA抗原和羊抗鼠Ig G包被在硝酸纤维素膜(NC膜)表面分别作为检测线和质控线。采用间接竞争法检测待检样品中的FB1与NC膜上的FB1-OVA抗原竞争结合金标抗体中的FB1单克隆抗体情况,并以检测线和质控线显示检测结果。[结果]本试验优化了金标抗体、检测抗原及羊抗鼠Ig G的包被量,检测FB1的灵敏度可达到2 ng·m L-1,最佳判定质量浓度为40 ng·m L-1。[结论]本试验制备的检测试纸...

建立快速、准确、简便易行的病害早期快速检测技术,是从事动物疫病防控研究工作者和产业界人士的迫切愿望。自从开辟免疫分析技术以来,越来越多更灵敏、更便捷的免疫分析方法被开发出来,以胶体金免疫层析法为基础建立起来的快速检测试纸,被认为是当前最快捷、高敏感的一种免疫学检测技术。该项技术真正实现了快速简易检测靶目标,并已在畜牧业中得到普及应用,成为当前畜禽病害早期防控的最有效方法之一。本文就该项技术在畜牧兽医领域的研究进展、应用现状、发展前景进行了介绍、分析和讨论,旨在为水产养殖动物病害的早期诊断提供借鉴,以期获得一种适用于水产动物病害的、专用的快速检测新技术和新产品。

通过对GenBank近10年内收录的O型口蹄疫(FMD)病毒VP1基因序列的同源性比较分析,并根据中国、老挝、缅甸等国家FMDV流行毒株的基因序列,设计并合成了有群内抗原代表性的结构蛋白VP1全基因序列.将合成的序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建了VP1的表达质粒pETVP1.SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG诱导下可特异性表达VP1蛋白,该重组蛋白以包涵体的形式存在,相对分子质量约30 000,能与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生特异性反应.动物接种试验表明,重组蛋白能诱导小白鼠产生特异性抗FMDV抗体.

【目的】喹诺酮类药物和庆大霉素均为高效、广谱抗菌药物,对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果,是中国畜牧业和水产业中常用的两类兽药。由于这两类药物在动物源性食品中的残留可能导致对人类健康的危害,因此,为了保护消费者的健康,研究和制定动物源性食品中同时检测这两类药物的残留检测方法对完善中国的食品安全监测体系具有重要意义。【方法】建立了同时检测牛奶中13种喹诺酮类和庆大霉素残留的胶体金免疫层析方法。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并对喹诺酮类和庆大霉素单克隆抗体按比例进行混合标记。同时,采用方阵法系统研究了胶体金标记这两类抗体时的pH值和抗体用量对灵敏度的影响,并对这两类药物抗...