利用定点突变方法,构建含有预期突变的口蹄疫病毒O/HN/93株全长cDNA克隆,将全长cDNA的重组质粒线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,转染细胞盲传至第3代50 h后出现典型致细胞病变效应(CPE),第4代10 h出现典型的CPE。对收获的病毒分别用RT-PCR、分子标签测序、间接免疫荧光和电镜观察等进行鉴定,均证实成功拯救到了O/HN/93株FMDV。成功获得O/HN/93株的感染性分子克隆,为进一步研究抗原谱广、免疫原性好的候选疫苗株奠定了骨架基础。

【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDVAsia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经NotI线化后和表达T7RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行病毒体内拯救的研究。【结果】转染细胞盲传第3代48h后出现致细胞病变(CPE),第4代10h出现典型的CPE。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的FMDV,而且存在分子标签,表明构建的FMDV全长cDNA分子克隆在BHK-21细胞内成功包装出FMDV。拯救毒与亲本毒...

将从Genbank中提出的20株O型FMDV的全基因组分割成12个编码区域,即Lab、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。通过方差分析,12个编码序列的相对变异率之间无差异(P>0.05);而这12种编码序列所对应的氨基酸相对突变率之间差异显著(P<0.01)。利用Duncan法对这12种氨基酸序列相对突变率进行多重比较,发现3A蛋白的氨基酸相对突变率比其余11种蛋白的差异都显著(P<0.05);VP2、Lpro的氨基酸相对突变率与VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间存在差异(P<0.05);而VP4、2A、2C、3Cpro、3Dpol之间无差异...

为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDVVP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析。结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性。结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础...

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)能引起偶蹄动物患一种名为口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）的高度接触性、发热性、急性的传染病。FMD的大规模爆发会导致整个国家或地区的动物和动物相关制品产量降低、贸易受限，造成巨大的经济损失。FMDV持续感染是造成FMDV容易蔓延并难以根除的重要原因。该文综述了FMDV持续感染期间病毒在体内的存在位置与感染特性，并以病毒与宿主细胞、宿主免疫系统之间的相互作用为重点，介绍了持续感染相关机制研究进展，总结了疫情防控相关策略，以期为解决FMDV持续感染问题提供参考。

构建共表达O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白前体P12A和蛋白酶3C的重组杆状病毒,为进一步研究FMDV空衣壳抗原和基因工程亚单位疫苗奠定基础。从质粒T-OP1中扩增出编码O型FM-DV衣壳蛋白前体的P12A基因,并将其插入到杆状病毒转移载体pFastDual-3C的PH启动子之下,构建重组杆状病毒转移载体pD-P12A3C。通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒B-P12A3C,转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒。重组杆状病毒经增殖并感染Sf9细胞后,通过双抗体夹心ELISA方法及间接免疫荧光来检测目的蛋白的表...

【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、AsiaI型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA)。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、AsiaI型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72and AsiaⅠ/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒。【结果】本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104LD50(1﹕128倍稀释乳鼠毒)的病毒量。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性...

【目的】O型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）不断变异，易导致现用疫苗与流行毒株的抗原匹配性下降引起免疫效果不佳，疫情零星散发。近年来，O型FMDV中SEA（东南亚）拓扑型流行活跃且不断变异，持续对口蹄疫防疫产生压力。系统解析O型FMDV毒株特异性抗原位点以及不同拓扑型毒株的序列差异，明确抗原变异的关键氨基酸，可为FMD抗原分子设计提供依据，为FMD防控提供指导。【方法】利用10株（SEA拓扑型）毒株特异性牛源单克隆中和抗体，对毒株O/GSLX/2010(O/Mya/98谱系)进行抗体压力筛选逃逸突变株，鉴定这10株抗体所识别表位的关键氨基酸。利用牛源多抗血清样本（32份）与逃逸突变毒株进行病毒交叉中和试验，分析SEA拓扑型毒株的免疫优势表位；通过序列比对分析不同拓扑型毒株在该抗原表位上的差异。利用反向遗传技术将差异性抗原表位引入O型FMDV经典疫苗株O/HN/CHA/93(Cathay拓扑型)，对拯救的点突变毒株测序分析后进行间接免疫荧光试验鉴定，并通过病毒蚀斑测定与一步生长曲线检测病毒的复制动力学。利用SEA拓扑型毒株特异性单克隆中和抗体，通过中和试验分析拯救突变株的抗原性，确定影响病毒抗原性的关键氨基酸，评估毒株特异性位点氨基酸的改变对抗原谱的影响。【结果】SEA拓扑型特异性抗原表位主要集中于结构蛋白VP1的B-C/C-D环，属于抗原位点3。10株抗体中多数抗体（8/10）识别的抗原表位在VP1上，其中有6株单抗（A19、B55、B74、C5、F53和F166）识别的关键氨基酸位于VP1 B-C环（T43、K45）及C-D环（P58），另外2株单抗（B66和F41）识别的关键氨基酸位于VP1 C末端。病毒交叉中和试验结果表明，VP1上43位和VP3上131位氨基酸的改变显著降低了牛源多抗血清的抗体效价。对O型FMDV不同谱系毒株（26株）序列进行分析，发现三种拓扑型毒株VP1 B-C/C-D环的28、47、56和58位氨基酸不同。利用反向遗传技术成功将毒株特异性抗原表位引入Cathay拓扑型毒株（O/HN/CHA/93），拯救出6株FMDV的点突变株：POZ-GSLX-M58、POZ-GSLX-M56/58、POZ-GSLX-M28/58、POZ-GSLX-M47/58、POZ-GSLX-M28/58/47和POZ-GSLX-M47/56/58。微量中和试验结果表明，VP1上56/58位对毒株抗原性起到关键作用；然而，进一步增加28位和47位突变会降低抗体B83的中和作用，影响毒株自身的抗原性。因此，VP1上56和58位氨基酸的改变可以扩展SEA拓扑型特异性中和mAbs对O/HN/CHA/93毒株的中和效力与广度。【结论】O型FMDV结构蛋白VP1上56和58位氨基酸是引起SEA拓扑型毒株抗原变异的关键位点，引入这些抗原决定簇可以拓展FMDV O/HN/CHA/93的抗原谱。研究为FMD防控及疫苗设计提供参考。

【背景】口蹄疫（foot and mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、烈性传染病，疫苗接种是预防临床口蹄疫的有效措施。免疫抗体水平监测则是评估疫苗免疫效果、制定免疫程序的重要依据，是免疫工作和疫情防控必不可少的关键环节，因此建立高效、快速、全自动的抗体检测方法具有重要意义。【目的】基于磁微粒（micromagnetic particles,MPs）化学发光免疫分析技术（CLIA），建立一种新型、全自动、可定量的口蹄疫病毒O型抗体检测方法，为口蹄疫免疫监测和疫情防控提供技术支撑。【方法】使用纳米材料磁微粒为固相载体和分离载体包被捕获抗体，用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）标记检测抗体，经过条件优化建立了一种新型磁微粒CLIA检测方法(magnetic particle chemiluminescence immunoassay,MP-CLIA)。本方法首先加入磁微粒-兔抗偶联物(magnetic particle-polyclonal antibodies,MPs-p Abs)、待测样本、口蹄疫病毒O型抗原，37℃孵育；再加入适量酶标抗体（ALP-p Abs),37℃孵育；最后加入化学发光底物AMPPD，检测相对发光强度（relative light unit,RLU）。研究通过检测标准品拟合标准曲线，并应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic,ROC）确定检测方法的判定标准；利用质控样本进行方法学评价，同时检测田间样本，并和液相阻断ELISA(LPB-ELISA）比对，验证临床检测效果。【结果】优化后最佳反应条件为磁微粒浓度0.25 mg·m L~(-1)、口蹄疫病毒O型抗原1﹕1 000稀释、酶标抗体1﹕2 000稀释、加样量20μL。整个检测过程均在全自动化学发光免疫分析仪中完成，反应时间20 min，在抗体含量0—1 280 U(效价0—1﹕2 048)范围内标准曲线R ~2>0.99，可进行定量检测。该方法敏感性为94.66%；特异性为97.10%，检测口蹄疫A型、Asia I型血清型特异性为97.14%，与塞内卡病毒（SVV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、牛流行热病毒（BEFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、羊痘病毒（QRFV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）抗体阳性血清无交叉反应；重复检测变异系数CV值<10%；田间样本检测结果与LPB-ELISA符合率为94.69%，定量结果相关系数R ~2为0.8473,P<0.0001，相关性显著。【结论】建立的MP-CLIA方法耗时短、操作简便，配套国产全自动化学发光仪，可进行全自动化检测，是一种新型、高效的口蹄疫病毒O型抗体定量检测方法，本方法对应的试剂盒已经完成中试生产和临床检测试验，在全国不同区域试用效果较好，具有较高的临床应用价值。

[目的]验证利用革兰氏阳性增强基质颗粒(GEM)浓缩纯化口蹄疫病毒(FMDV)抗原的可行性。[方法]将含有3个自溶素基序的锚钩蛋白基因(PA)与针对O型口蹄疫病毒特异性纳米抗体基因(VHH)串联克隆入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建原核表达载体p ET-VPA,将其转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3),表达获得融合重组蛋白VPA。先将GEM颗粒与重组蛋白VPA在37℃孵育30 min,离心,取沉淀用适量的FMDV抗原液重悬,再经一步低速离心,获得沉淀即为浓缩纯化的口蹄疫病毒抗原。利用SDS-PA

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-TEasy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定。该毒株与Poliovirus,Hepatitis Avirus和Human rhi-novirus 89毒株3C序列对比分析发现核苷酸序列一致性分别为38.8%,37.1%和36.5%,氨基酸序列一致性分别为23.7%,19.2%和17.6%。通过Swiss-pdbViewer软件模拟出FMDVOA/58 3C蛋白酶的3D结构和表面模型。并鉴定出此毒株3C蛋白酶的活性中心为Cys31-His46-Asp84。

以AF/72RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T easy体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoRI酶切法鉴定。应用BIMAS生物学软件对AF/72株结构蛋白VP1的H-2Dd、H-2Kd、H-2Ld、A20限制性T细胞表位进行预测,并对不同限制性的T细胞表位进行对比。结果表明,口蹄疫AF/72株结构蛋白VP1长639bp,编码213个氨基酸。不同限制性的T细胞表位虽然不尽相同,但与已鉴定的T细胞表位相比较,它们之间也有一些类似的、并且可能是通用型的T细胞表位。本试验通过生物信息学方法预测AF/72结构蛋白VP1的T细胞表位,为进一步试验确定...

为了分析FMDV AF72VP2蛋白结构和功能的关系。以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增目的基因,PCR纯化产物与pGEM-Teasy载体连接并转化JM109菌株,用凝胶电泳、PCR和SpeⅠ、SphⅠ双酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序。比对测序结果确定AF72 VP2的核苷酸序列,利用同源建模的方法建立AF72 VP2结构蛋白的3D结构,在此基础上,综合亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数预测AF72 VP2结构蛋白的B细胞抗原表位。分析表明,口蹄疫病毒VP1,VP2,VP3和VP4在核苷酸水平上的变异率是无差异的(P>0.05);而他们在氨基酸水平上的变异率差异显...

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T Easy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoR I酶切法鉴定。该毒株与A12,O1K,O1Campos和TW45/97毒株序列通过对比分析发现,L基因中有2个起始密码子,第二个是首选;并且确定氨基酸保守区主要位于第35～39,43～54,65～67,75～80,90～111,113～142,144～146,148～157,159～172和176～187位。L蛋白酶含有球状区域,碳端有一柔性杆状结构。合成的L蛋白酶可形成二聚体结构。第144位的Lys、148位的His和163位...

以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增结构蛋白VP1基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF72VP1的核苷酸序列和推导氨基酸序列,综合分析结构蛋白VP1的亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数,预测其潜在B细胞抗原表位并人工合成表位肽段,利用间接ELISA对潜在表位肽段进行筛选鉴定,结果显示,表位VP1a和VP1d为病毒株AF72结构蛋白VP1的优势B细胞表位,该结果为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供有价值的参考依据。