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[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙明 王宏伟 田克恭 王传彬 陈西钊 遇秀玲 金萍 曹振 许燕辉 赵心力
目的表达口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)非结构蛋白VPg1-2、VPg2-3、VPg3,用于FMDV感染与灭活疫苗动物鉴别诊断和其蛋白功能研究。方法对O型口蹄疫病毒太保毒株3ABC基因片段中的VPg1-2(3B1-2)、VPg2-3(3B2-3)、VPg3(3B3)基因进行扩增和亚克隆,并将它们分别插入pGEX-4T-1表达载体构建了重组表达质粒,经IPTG诱导后,进行Western blotting分析。以纯化的VPg1-2表达蛋白为抗原建立间接ELISA,对背景清楚的实验牛血清进行检测。结果表达的VPg1-2、VPg2-3蛋白可与FMDV阳性...
关键词：
口蹄疫病毒 非结构蛋白 抗体消长
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王玢瑸 哲名家 刘光清 张淼涛
【目的】构建重组兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)VPg(Viral Protein Ge-nome-Linked,VPg)蛋白基因的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化VPg蛋白,制备多克隆抗体,并检测抗体的基本特性。【方法】用PCR方法扩增RHDVVPg基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导,使之重组表达VPg蛋白,并用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。PCR扩增获得了345bp的VPg基因,用纯化的重组VPg蛋白免疫试验兔,制备抗VPg的多克隆抗体,用Wes...
关键词：
VPg 原核表达 多克隆抗体
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘新生 王永录
以AF/72RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T easy体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoRI酶切法鉴定。应用BIMAS生物学软件对AF/72株结构蛋白VP1的H-2Dd、H-2Kd、H-2Ld、A20限制性T细胞表位进行预测,并对不同限制性的T细胞表位进行对比。结果表明,口蹄疫AF/72株结构蛋白VP1长639bp,编码213个氨基酸。不同限制性的T细胞表位虽然不尽相同,但与已鉴定的T细胞表位相比较,它们之间也有一些类似的、并且可能是通用型的T细胞表位。本试验通过生物信息学方法预测AF/72结构蛋白VP1的T细胞表位,为进一步试验确定...
关键词：
口蹄疫病毒 T细胞表位 VP1蛋白
[期刊] 华北农学报
[作者]
毕研丽 沈小燕 丛国正 刘湘涛 常惠芸 才学鹏
为研究口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因的分子生物学特性及定位,构建了3D基因真核表达载体pEGFP-3D,观察了3D在BHK-21细胞中的瞬时表达情况。从重组质粒pMD18-T-3D扩增到3D基因,与pGEM-T easy载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pGEM-3D与表达载体pEGFP-N1分别经BamHⅠ/HindⅢ酶切,进行定向亚克隆;重组表达质粒pEGFP-3D经PCR、酶切鉴定,阳性质粒进行测序。利用脂质体介导阳性pEGFP-3D质粒转染BHK-21细胞,免疫组化检测转染细胞中3D基因表达情况和3D基因在细胞中的定位,Western blotting验证pEGFP-3D融合基因的表达。...
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨苏珍 张改平 鲍登克 乔松林 万博 樊剑鸣 职爱民 李学伍
为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDVVP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析。结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性。结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张昱 王永录 张永光 潘丽
采用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒(FMDV)AF72株的3D聚合酶基因,并将其克隆至pGEM-T easy载体,测序分析结果表明,AF72 3D聚合酶基因与GenBank中公布的其他4个参考序列均具有较高的同源性。将目的基因插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建了重组表达质粒pET-3D,鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,3D聚合酶基因在大肠杆菌中获得了正确表达,目的蛋白的分子量为46 ku。Western blot检测结果显示,表达产物可以与抗A型FMDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。
关键词：
口蹄疫病毒 3D聚合酶基因 原核表达
[期刊] 西南农业学报
[作者]
廖健淇 谢芝勋 张民秀 张艳芳 罗思思 李孟 谢志勤 谢丽基 邓显文 范晴 曾婷婷 黄娇玲 王盛
【目的】原核表达鸡细小病毒（ChPV）的NS1和VP2蛋白，制备其多克隆抗体，为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列，构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和pET-32a-VP2，将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌transsetta感受态细胞进行原核表达，优化表达条件，以十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳和免疫印迹（Western-blotting）方法鉴定NS1和VP2蛋白的表达情况。将表达产物免疫无特定病原体（SPF）鸡获得多克隆抗体，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定其效价，以Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体进行鉴定。【结果】SDS-PAGE分析结果显示，NS1和VP2蛋白条带大小分别约为104.0和87.0 kD，与预期条带大小相符。对重组质粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1进行最佳诱导条件筛选，结果显示NS1蛋白表达的最佳诱导条件为异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）终浓度1.0 mmol/mL，16 ℃诱导表达过夜；VP2蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.8 mmol/mL，20 ℃诱导表达过夜。可溶性分析结果显示，NS1和VP2蛋白主要以包涵体形式存在；间接ELISA检测NS1和VP2蛋白的多克隆抗体效价均为1︰10240000；Western-blotting鉴定结果表明，His标签蛋白和相对应的鸡多克隆抗体均能与NS1和VP2蛋白特异性结合；IFA分析结果显示，VP2和NS1蛋白多克隆抗体均能与ChPV特异性结合。【结论】成功表达ChPV的NS1和VP2蛋白和制备的鸡多克隆抗体，可作为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立ChPV血清学诊断方法的基础材料。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张娅 曾君祉 陈耀锋 黄华
为了生产一种可以直接口服的口蹄疫疫苗,以胡萝卜(Daucus carota L.var.sativa)无菌幼苗下胚轴诱导的愈伤组织为受体材料,通过农杆菌LBA4404介导的遗传转化,在CaMV双35S启动子的驱动下,将口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)结构蛋白VP1基因的活性肽片段(包括2个141~160位肽和1个200~213位肽的基因片段)导入胡萝卜愈伤组织细胞。经PCR和PCR-Southern杂交等方法鉴定转化苗,确认口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因已整合到胡萝卜染色体中,转化效率达到52%。SDS-PAGE试验结果初步证明,在转化苗总蛋白中有...
[期刊] 华北农学报
[作者]
常惠芸 丛国正 独军政 邵军军 林彤 冯金瑞 刘萍
将口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pET-28α(+)中,获得融合表达质粒pET-P1,转化E.coli.BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,pET-P1获得融合表达,Western Blot检测证实表达的融合蛋白具有免疫活性,表达产物主要以包涵体的形式存在,进一步采用纯化试剂盒纯化P1蛋白做为诊断抗原。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张昱 王永录 张永光 方玉珍 潘丽 蒋守田 吕建亮 刘力宽 张中旺 张淑刚 李正丰 杜进鑫
以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增结构蛋白VP1基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF72VP1的核苷酸序列和推导氨基酸序列,综合分析结构蛋白VP1的亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数,预测其潜在B细胞抗原表位并人工合成表位肽段,利用间接ELISA对潜在表位肽段进行筛选鉴定,结果显示,表位VP1a和VP1d为病毒株AF72结构蛋白VP1的优势B细胞表位,该结果为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供有价值的参考依据。
[期刊] 华北农学报
[作者]
高闪电 独军政 常惠芸 周建华 谢庆阁
首次从FMDV试验感染康复猪的舌皮和肺组织中克隆到了整联蛋白β1亚基的基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析。猪整联蛋白β1亚基基因的编码区含有2 397个核苷酸,编码798个氨基酸残基,含有10个潜在的糖基化位点(NXTX/NXSX),2个表皮生长因子相似结构域和3个半胱氨酸丰富区。其信号肽由20个氨基酸组成,胞外域由708个氨基酸组成,跨膜区由29个氨基酸组成,胞浆域由41个氨基酸组成。猪β1基因与牛、猩猩、猫、犬、人、小鼠和鸡的β1基因的核苷酸序列一致性分别为99.5%,90.0%,91.8%,90.7%,90.2%,86.5%和77.4%,推导的氨基酸序列一致性分...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨继飞 杨苏珍 杨艳艳 职爱民 赵东 郅玉宝 邢广旭 邓瑞广 柴书军 张改平
【目的】建立合成多肽抗原检测FMD NSP抗体的ELISA方法。【方法】固相法合成特异性FMDV NSP B细胞表位肽,将其偶联在BSA载体蛋白上,作为抗原包被在ELISA板上,制备检测抗FMDV NSP抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。【结果】抗原包被浓度选择2.5μg·mL-1;检测199份血清标本,与美国UBI商品试剂盒符合率达到96.48%,与国产3ABC ELISA比较,符合率为97.48%,显示极好的一致性。【结论】该合成肽ELISA试剂盒可以用以检测NSP抗体,从而鉴别FMD的自然感染与疫苗免疫,试剂盒特异性强,重复性好、稳定性高,操作简便。
关键词：
FMDV ELISA 合成肽
[期刊] 华北农学报
[作者]
田飞鹏 曹轶梅 卢曾军 孙普 高云英 刘在新
构建共表达O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白前体P12A和蛋白酶3C的重组杆状病毒,为进一步研究FMDV空衣壳抗原和基因工程亚单位疫苗奠定基础。从质粒T-OP1中扩增出编码O型FM-DV衣壳蛋白前体的P12A基因,并将其插入到杆状病毒转移载体pFastDual-3C的PH启动子之下,构建重组杆状病毒转移载体pD-P12A3C。通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒B-P12A3C,转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒。重组杆状病毒经增殖并感染Sf9细胞后,通过双抗体夹心ELISA方法及间接免疫荧光来检测目的蛋白的表...
关键词：
口蹄疫病毒 衣壳蛋白 重组杆状病毒 构建
[期刊] 华北农学报
[作者]
于天飞 谢鹏宇 孙婉姝 李静 尹海畅 黎明 于志丹
为了在大肠杆菌中表达抗鹅细小病毒(GPV) NS1蛋白单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,并测定其与NS1蛋白结合活性。对抗GPV NS1蛋白单克隆抗体VL、VH基因核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化,人工合成获得了含有可变区基因的重组质粒pUC57-VL和pUC57-VH。然后用Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切pUC57-VL、pUC57-VH,回收340 bp的VL基因和370 bp的VH基因。目的基因通过Bam HⅠ/XhoⅠ多克隆位点分别插入至原核表达载体pET-32a,获得重组质粒pET-VL和pET-VH。重组质粒经Bam HⅠ单酶切和Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。重组质粒分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白TRX-VL和TRX-VH的表达,分子量分别为30.3,31.4 ku。纯化后的重组蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性结合,鉴定结果表明,获得的纯化蛋白为目的蛋白。间接ELISA分析表明,0.4μg的TRX-VH可与25 ng的GST-NS1蛋白特异性结合而0.4μg的TRX-VL不能与各包被量的GST-NS1蛋白特异性结合,TRX-VH与GST-NS1蛋白的特异性结合可被1∶200稀释的GPV感染鹅血清完全阻断。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
代文君 王洪梅 刘晓 高运东 于力 王立群 仲跻峰 何洪彬
【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。
关键词：
口蹄疫病毒 VP1 转染 稳定细胞系
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