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[期刊] 华北农学报
[作者]
刘新生 王永录
以AF/72RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T easy体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoRI酶切法鉴定。应用BIMAS生物学软件对AF/72株结构蛋白VP1的H-2Dd、H-2Kd、H-2Ld、A20限制性T细胞表位进行预测,并对不同限制性的T细胞表位进行对比。结果表明,口蹄疫AF/72株结构蛋白VP1长639bp,编码213个氨基酸。不同限制性的T细胞表位虽然不尽相同,但与已鉴定的T细胞表位相比较,它们之间也有一些类似的、并且可能是通用型的T细胞表位。本试验通过生物信息学方法预测AF/72结构蛋白VP1的T细胞表位,为进一步试验确定...
关键词：
口蹄疫病毒 T细胞表位 VP1蛋白
[期刊] 华北农学报
[作者]
张昱 王永录 张永光 方玉珍 潘丽 蒋守田 吕建亮 刘力宽 张中旺 张淑刚 李正丰 杜进鑫
以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增结构蛋白VP1基因,PCR纯化产物与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,对经凝胶电泳、PCR和EcoRⅠ酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序,通过序列比对获得AF72VP1的核苷酸序列和推导氨基酸序列,综合分析结构蛋白VP1的亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数,预测其潜在B细胞抗原表位并人工合成表位肽段,利用间接ELISA对潜在表位肽段进行筛选鉴定,结果显示,表位VP1a和VP1d为病毒株AF72结构蛋白VP1的优势B细胞表位,该结果为进一步的FMDV多表位疫苗研究提供有价值的参考依据。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨苏珍 张改平 鲍登克 乔松林 万博 樊剑鸣 职爱民 李学伍
为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDVVP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析。结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性。结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张昱 王永录 张永光 潘丽
采用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒(FMDV)AF72株的3D聚合酶基因,并将其克隆至pGEM-T easy载体,测序分析结果表明,AF72 3D聚合酶基因与GenBank中公布的其他4个参考序列均具有较高的同源性。将目的基因插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建了重组表达质粒pET-3D,鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,3D聚合酶基因在大肠杆菌中获得了正确表达,目的蛋白的分子量为46 ku。Western blot检测结果显示,表达产物可以与抗A型FMDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。
关键词：
口蹄疫病毒 3D聚合酶基因 原核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
代文君 王洪梅 刘晓 高运东 于力 王立群 仲跻峰 何洪彬
【目的】构建口蹄疫病毒VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1,并建立稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。【方法】采用RT-PCR技术从口蹄疫病毒材料中扩增出VP1基因,并将其连入慢病毒载体FG9中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,转染BHK-21细胞,96h后经流式细胞分选筛选GFP阳性细胞,细胞增殖后经WB检测VP1基因的表达。【结果】VP1基因重组慢病毒载体FG9-VP1测序正确,转染BHK-21细胞经流式细胞仪筛选的GFP阳性细胞后可稳定表达VP1基因。【结论】VP1基因重组慢病毒载体构建成功并获得了稳定表达VP1基因的BHK-21细胞系。
关键词：
口蹄疫病毒 VP1 转染 稳定细胞系
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈启伟 王永录 张永光 潘丽 方玉珍 刘力宽 蒋守田 吕建亮 周鹏 张中旺 张昱 张淑刚 杜进鑫 李正丰 王刚
为了分析FMDV AF72VP2蛋白结构和功能的关系。以口蹄疫病毒株AF72 RNA为模板,反转录并扩增目的基因,PCR纯化产物与pGEM-Teasy载体连接并转化JM109菌株,用凝胶电泳、PCR和SpeⅠ、SphⅠ双酶切法鉴定为阳性的重组质粒进行测序。比对测序结果确定AF72 VP2的核苷酸序列,利用同源建模的方法建立AF72 VP2结构蛋白的3D结构,在此基础上,综合亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数预测AF72 VP2结构蛋白的B细胞抗原表位。分析表明,口蹄疫病毒VP1,VP2,VP3和VP4在核苷酸水平上的变异率是无差异的(P>0.05);而他们在氨基酸水平上的变异率差异显...
[期刊] 华北农学报
[作者]
周建华 丛国正 高闪电 常惠芸
以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoR I酶切法鉴定。运用同源模建得到OA/58 VP1蛋白3D结构,并结合理化性质、亲水性、可塑性和免疫原性进行分析,预测OA/58 VP1的抗原表位。结果OA/58 VP1存在多个潜在的抗原表位位点,可能的蛋白质抗原表位区域:2～11,15～35,38～50,77～88,90～107,121～125,131～135,140～149,154～163,169～175,178～189,197～213。应用同源模建得到的OA/58 VP1蛋...
关键词：
口蹄疫病毒 VP1蛋白 B细胞抗原表位
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张娅 曾君祉 陈耀锋 黄华
为了生产一种可以直接口服的口蹄疫疫苗,以胡萝卜(Daucus carota L.var.sativa)无菌幼苗下胚轴诱导的愈伤组织为受体材料,通过农杆菌LBA4404介导的遗传转化,在CaMV双35S启动子的驱动下,将口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)结构蛋白VP1基因的活性肽片段(包括2个141~160位肽和1个200~213位肽的基因片段)导入胡萝卜愈伤组织细胞。经PCR和PCR-Southern杂交等方法鉴定转化苗,确认口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因已整合到胡萝卜染色体中,转化效率达到52%。SDS-PAGE试验结果初步证明,在转化苗总蛋白中有...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张中旺 张永光 王永录 潘丽 方玉珍 刘力宽 蒋守田 吕建亮 周鹏 张昱 张淑刚 杜进鑫 李正丰
对口蹄疫病毒Asia1/HeB株P1结构蛋白基因进行了扩增、克隆及序列测定。采用DNAStar Protean软件对P1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性、表面可及性及抗原指数等参数进行分析,综合预测其B细胞表位分布。结果表明,FMDV Asia I/HeB株P1基因长2199 bp,包含完整的开放阅读框,编码733个氨基酸,其中VP1长633 bp,编码211个氨基酸,VP2长654 bp,编码218个氨基酸,VP3长657 bp,编码219个氨基酸,VP4长255 bp,编码85个氨基酸。P1结构蛋白的二级结构较为复杂,含有较多的β片层结构和转角结构,VP1、VP2和VP3上均有多个区域为B细...
关键词：
口蹄疫病毒 结构蛋白 测序 B细胞表位
[期刊] 华北农学报
[作者]
周建华 丛国正 高闪电 常惠芸
以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pMD18-T载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和BamH I,Hind III双酶切法鉴定。运用同源模建得到OA/58 VP2蛋白三维空间结构,并结合理化性质、亲水性、可塑性和免疫原性进行分析,找出OA/58 VP2蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,OA/58 VP2蛋白存在多个潜在的抗原表位,可能的蛋白质抗原表位区域:1~23,40~63,71~78,82~91,102~106,113~119,131~138,148~154,166~177,189~196,212~218。应用同源模建得到的O...
关键词：
口蹄疫病毒 VP2蛋白 B细胞抗原表位
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王文秀 顾节清 陈德坤 邓文 潘丽 王宝琴 王永录 张永光
将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因克隆到植物表达质粒pB in438中,构建了植物表达载体pB in-VP 1,通过根癌农杆菌叶盘转化法,将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP 1基因导入NC 89烟草基因组中,对经卡那霉素筛选获得的20株抗性植株,进行PCR和RT-PCR检测。结果表明,抗性烟草植株中已整合了VP 1基因。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙明 王宏伟 田克恭 王传彬 陈西钊 遇秀玲 金萍 曹振 许燕辉 赵心力
目的表达口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)非结构蛋白VPg1-2、VPg2-3、VPg3,用于FMDV感染与灭活疫苗动物鉴别诊断和其蛋白功能研究。方法对O型口蹄疫病毒太保毒株3ABC基因片段中的VPg1-2(3B1-2)、VPg2-3(3B2-3)、VPg3(3B3)基因进行扩增和亚克隆,并将它们分别插入pGEX-4T-1表达载体构建了重组表达质粒,经IPTG诱导后,进行Western blotting分析。以纯化的VPg1-2表达蛋白为抗原建立间接ELISA,对背景清楚的实验牛血清进行检测。结果表达的VPg1-2、VPg2-3蛋白可与FMDV阳性...
关键词：
口蹄疫病毒 非结构蛋白 抗体消长
[期刊] 华北农学报
[作者]
毕研丽 沈小燕 丛国正 刘湘涛 常惠芸 才学鹏
为研究口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因的分子生物学特性及定位,构建了3D基因真核表达载体pEGFP-3D,观察了3D在BHK-21细胞中的瞬时表达情况。从重组质粒pMD18-T-3D扩增到3D基因,与pGEM-T easy载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pGEM-3D与表达载体pEGFP-N1分别经BamHⅠ/HindⅢ酶切,进行定向亚克隆;重组表达质粒pEGFP-3D经PCR、酶切鉴定,阳性质粒进行测序。利用脂质体介导阳性pEGFP-3D质粒转染BHK-21细胞,免疫组化检测转染细胞中3D基因表达情况和3D基因在细胞中的定位,Western blotting验证pEGFP-3D融合基因的表达。...
[期刊] 华北农学报
[作者]
杜进鑫 王永录 张永光 方玉珍 蒋守田 吕建亮 潘丽 刘力宽
用口蹄疫A型病毒AF/72株的第3代乳鼠组织毒,通过乳鼠继续适应3代后,转适BHK-21细胞,获得该毒株的细胞毒AF/72/MF6/BF12,经测定其TCID50为10-8.0/mL;经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其他6株口蹄疫A型病毒株比对,同源性均大于85%;经无菌检验和外源病毒检验,纯净性达到兽用生物制品标准要求;经间接夹心ELISA测定,OD值均大于0.2,且该毒仅能被口蹄疫A型标准血清中和,具有型特异性;经紫外分光光度法测定其146S含量,均值为189 ng/mL,远大于22 ng/mL的国际标准。综合纯净性检验结果、特异性检验结果和146S含量,确定AF...
关键词：
口蹄疫A型病毒 FMD 毒株
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