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[期刊] 淡水渔业
[作者]
周康奇 潘贤辉 刘奕 牟希东 郑曙明 胡隐昌 宋红梅 杨叶欣
为探究卵黄蛋白受体(Vitellogenin receptor,Vtgr)在双须骨舌鱼性腺发育的作用及组织表达规律,本研究运用RACE技术首次克隆获得双须骨舌鱼vtgr cDNA全序列,该序列全长为2 841 bp,开放阅读框(ORF)为2 556bp,编码氨基酸851个,5’端非编码区26 bp,3’端非编码区258 bp。生物信息学分析显示,vtgr蛋白分子质量为93.6 ku,等电点为4.78,含有8个低密度脂蛋白受体A结构域(LDLa),5个低密度脂蛋白受体YWTD结构域(LY),2个类表皮生长因子结构域(EGF),1个钙结合类表皮生长因子结构域(EGF-CA),1个跨度为23个氨基酸的跨膜结构域,属于极低密度脂蛋白受体(vldlr),是亲水性跨膜蛋白。多序列比对分析表明,双须骨舌鱼vtgr高度保守,与美丽硬仆骨舌鱼(Scleropages formosus)相似度最高为95.96%。系统进化树分析发现,与美丽硬仆骨舌鱼聚为一支,与鲽形目、鲤形目、鲑形目亲缘性较远。qRT-PCR结果分析发现,双须骨舌鱼vtgr在雌雄鱼的8个不同组织中均有表达,在卵巢和精巢中的相对表达量显著高于鳃、肝、脾、心脏、头肾、脑等组织(P<0.05)。此外,vtgr在雌雄鱼性腺发育Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期表达分析表明,在卵巢中vtgr相对表达量依次递减,且Ⅱ期显著高于Ⅲ和Ⅳ期(P0.05),但Ⅱ和Ⅲ期表达量显著低于卵巢(P<0.05)。研究表明,vtgr基因编码区序列有较高保守性。Vtgr在双须骨舌鱼前期卵巢发育中发挥着重要作用。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
林景卫 段作文 关山越 韩笑 范文丽 李浩戈 张丽 陈水森 李天来
树舌灵芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ａｐｐｌａｎａｔｕｍ）为灵芝属内独特的一类，克隆树舌灵芝免疫调节蛋白（ｆｕｎＧａｌ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｆｉｐ）基因，对其进行生物信息学分析并构建真核表达载体，将为高效表达重组树舌灵芝ｆｉｐ和揭示其生物学功能奠定基础。采用染色体步移的方法从树舌灵芝菌丝体基因组ｄｎａ中扩增得到１个新型真菌免疫调节蛋白基因—ｆｉｐ－Ｇａｐ，对其核苷酸序列进行生物信息学分析，结果表明，ｆｉｐ－Ｇａｐ基因属于灵芝属ｆｉｐ家族，含有３４２ ｂｐ，编码１１３个氨基酸。对其氨基酸序列分析表明：树舌灵芝免疫调节蛋白ｆｉｐ－Ｇａｐ分子量为１２．７ ｋ ｄ，理论等电点为．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘春 李凯彬 王芳 聂湘平 吴淑勤
本研究通过对剑尾鱼(Xiphophorus helleri)卵黄蛋白原基因片段的克隆和表达,建立了剑尾鱼卵黄蛋白原蛋白检测方法。根据已发表的底(Fundulus heteroclitus)卵黄蛋白原mRNA序列设计引物,利用RT-PCR法扩增出1段1118 bp的剑尾鱼卵黄蛋白原cDNA片段,序列分析表明该片段与其他鱼类卵黄蛋白原基因序列相似性较高,其中与底和食蚊鱼(Gambusia affinis)的同源性分别达87.4%和96.7%。在对该片段所编码氨基酸序列可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,预期得到258个氨基酸的表达蛋白。表达载体转入大肠杆菌DH5α,经热诱导后...
关键词：
剑尾鱼 卵黄蛋白原 原核表达 检测
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
袁新程 施永海 徐嘉波 于爱清 邓平平 张之文 蒋飞
为探明美洲鲥(Alosa sapidissima)雌鱼发育后期卵巢内营养物质的变化规律，提高卵子受精率，采用生化分析、酶联免疫吸附及荧光定量PCR等方法，对性腺发育期Ⅳ期和Ⅴ期的卵巢内氨基酸、脂肪酸、卵黄蛋白原（VTG）和组织蛋白酶D（CTSD）含量及其mRNA表达量进行对比分析。结果显示，Ⅳ期卵巢中水分含量(75.73%)显著低于Ⅴ期(90.64%)(P<0.05)，而粗蛋白含量(16.07%)、粗脂肪含量(2.86%)和粗灰分含量(1.28%)均显著高于Ⅴ期 (5.83%、1.25%、0.81%)(P<0.05)。在Ⅳ、Ⅴ期卵巢内各检测出18种氨基酸，其中谷氨酸含量最高(8.64%和8.13%)；8种必需氨基酸中，Ⅳ期苏氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和色氨酸含量均显著高于Ⅴ期 (P＜0.05)，且二者第一限制氨基酸均为色氨酸；Ⅳ期氨基酸总量(TAA)、半必需氨基酸(HEAA)和非必需氨基酸总量(NEAA)均显著高于Ⅴ期(P＜0.05)。两期卵巢内共检测出19种脂肪酸，Ⅳ期C17:0、C20:1n9、C20:4n6和C20:5n3含量显著高于Ⅴ期(P＜0.05)；其中∑MUFA、∑PUFA、∑UFA、∑n3PUFA和EPA+DHA含量均大于Ⅴ期，∑UFA (70.54%)达到显著性差异(P＜0.05)。Ⅳ期卵巢中VTG含量高于Ⅴ期，但不显著(P＞0.05)；而Ⅳ期卵巢中CTSD含量明显比Ⅴ期低 (P＜0.05)。Ⅴ期卵巢VTG 基因表达量是Ⅳ期的13.88倍(P＜0.05) ；而Ⅴ期肝脏内VTG 基因表达明显低于Ⅳ期(P＜0.05)，是Ⅳ期的25%。从Ⅳ期至Ⅴ期，卵巢中CTSD mRNA表达出现下调，肝脏中CTSD mRNA表达出现上调，但均不明显。因此，当前养殖条件下，美洲鲥雌鱼亲本后期发育过程中，卵巢内营养物质积累不均衡，建议适当调整饲料配方，提高限制性氨基酸色氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸及含量较低的赖氨酸、苏氨酸比例和调高多不饱和脂肪酸C20:3n6、C20:4n6(AA)、C22:6n3(DHA)和C20:5n3(EPA)比例，降低C18:2n6c的比例，保证卵巢后期发育所需营养的均衡。
[期刊] 水产学报
[作者]
刘春 李凯彬 王芳 王庆 聂湘平 王英英 吴淑勤
利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法,克隆获得剑尾鱼卵黄蛋白原C(Vg C)基因的全长cDNA序列。剑尾鱼Vg C基因cDNA序列全长4 011 bp,其5'非编码区包含12 bp和3'非编码区包含246 bp;含有一个3 753 bp的开放阅读框(ORF),编码1 250个氨基酸,推测其编码氨基酸分子量大小为141.7 ku,编码氨基酸序列与其他鱼类卵黄白原C编码氨基酸序列相似性在44%～85%。荧光定量PCR结果显示,Vg C在剑尾鱼肝脏中表达量最高,脾、肾、卵巢中有微量表达,脑、肌肉、鳃中几乎没有检测到表达;对不同时间暴露在雌激素中剑尾鱼肝脏进...
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
林景卫 关山越 钟鸣 陈丽静 李浩戈 张丽 范文丽 李天来
[期刊] 华北农学报
[作者]
邢波建 于淼 吴迪 徐笑 李连艳 刘玉芬
Toll样受体是参与机体天然免疫的一类模式分子,可以识别多种病原体相关分子模式,快速启动有效的免疫应答,在机体的抗感染免疫中发挥重要的作用。为了深入探讨鸡Toll样受体的免疫功能,为禽类相关疾病的预防和控制提供依据,试验通过RT-PCR技术克隆海兰褐鸡TLR15基因的全长阅读框,同时将其胞外区片段插入载体p ET32a并导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行优化表达,经SDS-PAGE和Western Blot法检测融合蛋白,并将融合蛋白作为免疫原免疫昆明鼠后制备多克隆抗体,同时采用免疫组织化学的方法,对ch TLR15的组织表达进行检测。结果表明,海兰褐鸡TLR15编码基因全长2 607 bp,编码868个氨基酸残基,其中胞外区1 962 bp,重组蛋白分子量约为72 ku;免疫小鼠可以产生特异性的抗体,抗体效价为1∶10 000;免疫组化检测结果显示,ch TLR15主要在脾脏中表达,在肝脏和肺部表达较少。研究结果可为禽类TLR15相关的免疫调节机制分析提供物质基础,也可为后续抗感染生物制剂的开发奠定基础。
关键词：
海兰褐鸡 TLR15 表达 序列分析
[期刊] 中国农业科学
[作者]
罗娟 陈恩祥 刘红玲 彭芷昕 杨从文 沈关望 张海燕 邢润苗 林英 夏庆友
【目的】克隆家蚕卵黄原蛋白受体(vitellogenin receptor,VgR),分析其在昆虫细胞中的表达特征,了解正常VgR和突变VgR的表达模式,为阐明其生物学功能提供参考依据。【方法】基于家蚕VgR的基因编码序列设计特异引物,扩增的目的片段连接到载体pET28a上,构建原核表达载体,转化E.coil BL21(DE3)表达菌株,IPTG诱导获得目的蛋白;用镍柱亲和层析方法纯化诱导表达的家蚕VgR肽蛋白;将纯化后的肽蛋白制备BmVgR的兔源多克隆抗体;PCR扩增获得大造和突变型白妙卵(scanty vitellin,vit)的LBD1+EGF1结构域(C11D和C11V)片段,连接到细...
关键词：
家蚕 卵黄原蛋白受体 原核表达 细胞表达
[期刊] 淡水渔业
[作者]
姚苗 韦智梅 BIZOZA 周针宇 李虹 王波 熊银林 刁晓明 翟旭亮
为探究中华鳖(Pelodiscus sinensis)卵黄蛋白原Vtg基因的生物学信息与表达及其作为生理与毒理研究标志物的可行性，本实验克隆获得VtgAB1、VtgAB2、VtgAB3(GenBank登录号OK287927、OK287929、OK287928)基因序列，其cDNA长分别为5 055、5 537、5 306 bp,分别编码了1 684、1 760、1 725个氨基酸。三种亚型Vtg蛋白均由脂蛋白N-末端(Vitellogenin＿N)、1943DUF、1944DUF、PV、D型血管血友病因子(VWD)5个保守结构域构成，为完整型Vtg。同源性分析发现皆与龟鳖目具有更近的亲缘关系，同时在3种亚型中VtgAB2与VtgAB3更相似。荧光定量PCR显示，3种亚型Vtg只在雌性肝脏中强烈表达。在60日龄、2龄、4龄雌性个体肝脏中，Vtg表达量随年龄呈上升趋势，VtgAB1、VtgAB2为主要表达亚型。原位杂交结果显示，3种亚型Vtg在卵原细胞内未发现杂交信号；在生长期卵母细胞胞质和滤泡细胞中发现杂交信号；成熟期卵母细胞胞质中未发现杂交信号，在滤泡细胞和周围的网状组织中发现杂交信号。信号在初级卵母细胞的细胞质中分布较为均匀且表达最强，随着卵母细胞的发育信号聚集在核周区且信号逐渐减弱。以雄性中华鳖为对象，注射雌激素E2,3种亚型Vtg表达量表现出明显的时间和剂量相关性。研究结果表明，在中华鳖卵黄积累过程中Vtg发挥重要作用，首次证实其Vtg存在内源性合成，并发现其可以作为雌激素暴露的生物标志物。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘红 崔俊 颜婕 蔡生力
从成熟的克氏原螯虾卵巢中提取总RNA,通过同源克隆得到了卵黄蛋白原受体c DNA部分序列,长度为506 bp,在NCBI网站上进行比对后发现,其与斑节对虾、短沟对虾、罗氏沼虾的卵黄蛋白原受体(Vg R)c DNA序列有较高的相似性。采用实时荧光定量PCR方法,测定了卵巢不同发育时期卵巢和肝胰腺两个组织中卵黄蛋白原受体m RNA的相对表达水平。结果显示,卵巢是卵黄蛋白原受体基因表达的主要部位,而肝胰腺只能检测到少量表达,卵黄蛋白原受体基因在卵巢的卵原细胞增殖期相对表达量最高,随后下降,成熟期达到最低值,恢复期开始回升。结合卵巢不同发育阶段卵巢质量的变化计算表达总量,结果发现,卵黄蛋白原受体基因的...
关键词：
卵黄蛋白原受体 克氏原螯虾 克隆 表达量
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘祥
对溶藻弧菌外膜蛋白ＯｍｐＵ进行分子克隆构建，抗原性生物信息学分析，为疫苗的开发奠定了基础。通过分子克隆获得ＯｍｐＵ蛋白的原核表达菌株，重组表达后利用切胶纯化获得ＯｍｐＵ蛋白，免疫小鼠制备抗血清，Ｗｅｓｔｅｒｎ ＢｌＯｔｔｉｎｇ检测发现ＯｍｐＵ蛋白具有很好的抗原性。采用在线软件预测ＯｍｐＵ为亲水的分泌型蛋白；存在多个酶切位点。采用ｔｍＨｍｍ ｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０程序预测ＯｍｐＵ无跨膜结构并定位于细胞膜外。通过ｓｉｇｎａｌ ｐ ４．１软件分析发现ＯｍｐＵ的１～２１位氨基酸为信号肽序列。ｓＯｐｍａ服务器预测ＯｍｐＵ的二级结构含无规则卷曲２７．９４％，α－螺旋为３３．２４％，β－转角为１０．２９％．．．
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘云云 李智敏 程毅 余永廷 陈佳 严准
运用生物信息学手段分析pep1基因结构,并根据GenBank中玉米瘤黑粉菌pep1 DNA序列设计引物,从玉米瘤黑粉菌SG200的基因组中扩增得到了pep1基因全长,构建了pET–28a–pep1重组表达质粒,选用大肠埃希菌BL21(DE3)作为宿主菌,以1 mmol/L IPTG诱导表达。SDS–PAGE检测结果表明,诱导表达产物大小与理论值(20 800)一致,说明pET–28a–pep1能够在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达。
[期刊] 水产学报
[作者]
罗洪林 张瑶瑶 梁万文 陈福艳 李旻 甘西
运用生物信息学技术分析罗非鱼热休克蛋白70(tilapia heat shock protein,t HSP70)的理化特性、糖基化位点、跨膜区域、蛋白的细胞定位及信号肽与虹鳟等其他动物HSP70的相似性,以人工合成c DNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增其完整CDS,并将此DNA片段与真核表达载体p GAPZa-A连接,构建p GAPZa-HSP70表达质粒,在毕赤酵母GS115中表达t HSP70蛋白,对表达上清液进行SDS-PAGE及Western-blotting分析后,采用Ni2+IDA层析脱盐纯化目的蛋白,并对所表达的蛋白进行糖基化PAS染色鉴定。对表达的蛋白进行SDS-PAGE后...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
罗明坤 赵金良 Thammaratsuntorn Jeerawat 李传阳 魏继海 赵永华
通过组织切片、酶联免疫吸附及荧光定量PCR等方法,研究了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)卵巢发育过程中性类固醇激素(雌二醇E2、孕酮P)、卵黄蛋白原(Vtg)含量及Vtg mRNA相对表达水平变化规律。结果表明,尼罗罗非鱼性腺指数(GSI)与卵巢成熟发育间呈同步性变化,Ⅴ期达到峰值。血清中E2含量自卵巢Ⅱ期开始显著升高,Ⅳ期达到峰值,Ⅴ期后显著下降;血清P含量自卵巢Ⅱ期开始不断升高,Ⅴ期达到峰值,Ⅵ期显著下降;E2、P分别在卵巢成熟发育前期与后期发挥作用。肝中Vtg含量先升、后降,Ⅳ期达峰值;血清、卵巢中Vtg含量均自Ⅱ期开始增加,Ⅴ期达峰值,Ⅵ期显著降低;不同组织中V...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孙超 王力 齐仁立 姜东凤
【目的】克隆猪Musclin基因,分析和预测其编码蛋白的结构与功能。【方法】从猪肌肉组织中提取总RNA,RT-PCR扩增获得Musclin基因,对其进行克隆和测序,并根据生物信息学分析方法,利用Tmpred、SignalP3.0、TargetP 1.1等分析软件,对猪Musclin蛋白的跨膜结构、信号肽、细胞定位、结构特征等进行分析和预测。【结果】猪Musclin蛋白主要集中在分泌途径上,存在于细胞外,其核苷酸序列与家兔的具有较高的相似性,氨基酸序列32～45位和55～63位存在2个可能的强跨膜螺旋区,该蛋白的空间结构以α螺旋、β转角和无规则卷曲为主;其1～26位氨基酸序列是一段信号肽,在26...
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