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[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈阳婷 桑有顺 冯焱 陈涛
为建立快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR检测马铃薯病毒技术,依据马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,从反转录和PCR等方面优化双重RT-PCR反应条件,同步扩增出上述四4种病毒,分别得到620(PVX)、435(PVS)、300(PVA)、222 bp(PLRV)大小的扩增片段。结果表明,反转录反应中引物浓度比例、dNTPs浓度和PCR反应中Mg2+浓度对双重RT-PCR检测多种马铃薯病毒的影响较大。优化的双重RT-PCR反应体系可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此方法还适合检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒...
关键词：
马铃薯 RT-PCR 病毒检测
[期刊] 西南农业学报
[作者]
白建明 杨琼芬 李先平 隋启君
采用TR IZOL试剂盒和异硫氰酸胍法2种方法提取了带PVX马铃薯试管苗的总RNA。根据设计好的1对特异性引物,运用反转录PCR技术对提取的总RNA进行了体外扩增。结果表明,所用2种方法都能有效地提取马铃薯RNA,并适合于反转录合成病毒cDNA,得到了与预期大小相一致的720 bp片段,而对照未得到任何产物。但利用TR IZOL试剂盒进行RNA提取价格较贵,而异硫氰酸胍法所用试剂可自己配制,方法灵活,价格较TR IZOL试剂盒便宜。从而建立了经济简便的PVX RT-PCR检测体系,为PVX的防治、脱毒种薯和核心种苗的检测提供有效手段。
关键词：
PVX RT-PCR 病毒检测’体系
[期刊] 西南农业学报
[作者]
阎文昭 蒲志刚 钟婷婷
根据5种主要的马铃薯病毒外壳蛋白基因序列,分别合成了5对寡聚核苷酸引物,从马铃薯病叶组织中提取出病毒总RNA,进行cDNA合成和PCR扩增,得到了与预期片段长度一致的PCR特异扩增产物。建立了马铃薯病毒检测的RT-PCR体系,并将建立的体系应用于四川省的马铃薯病毒病的检测,在基因水平上为四川省的马铃薯检测提供了新的手段。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
冯光惠 杜虎平 李夏隆 亢福仁
【目的】分析陕北8个县(区)马铃薯X病毒外壳蛋白(CP)基因序列的一致性和变异性,明确病毒变异程度,为脱毒马铃薯的推广提供参考。【方法】以陕北8个县(区)种植2~3代疑似携带病毒的马铃薯叶片为材料,首先用Trizol法提取8个采样点马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯X病毒CP基因序列设计特异引物,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;然后对CP基因进行克隆并测序,使用DNAstar软件分析陕北马铃薯X病毒CP基因序列的一致性,并与国内外其他地区12个马铃薯X病毒进行比较,采用邻接法构建系统进化树。【结果】从陕北8个县(区)马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的长度为...
[期刊] 华北农学报
[作者]
吴志明 贾晓梅 谢晓亮 温春秀 田伟 张庆良
根据马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,经RT PCR法扩增出全长的cDNA片段,结果从感病组织中扩增出与预期的360bp大小的目标片段,而健康组织无此扩增产物;将其克隆到质粒pGEM T载体上,进行全序列分析。结果表明,与国内外的报道相比较,核苷酸同源率高达98%以上。PCR产物克隆作为RT PCR反应的阳性对照,解决了毒源保存和传播的问题,为进一步进行抗PSTVd基因工程研究打下了良好基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
梁学超 向本春 程朝玲 苏海娣 郑银英
本文通过一步法RT-PCR技术,检测新疆加工番茄马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)感染率。结果表明,新疆加工番茄马铃薯Y病毒感染率为25%。选取10个样品利用RT-PCR技术,克隆CP基因,获得807 bp全长CP基因,编码268个氨基酸。CP基因序列比对分析与系统进化树分析表明,侵染新疆加工番茄的马铃薯Y病毒属于PVYN:O株系。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
邱又彬 陶刚 黄永会 李奇科 刘作易 朱英 郑世玲
利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)技术从马铃薯病毒发病叶片中检测并克隆到PVX、PVY和PLRV3种病毒及其外壳蛋白基因的全长序列,长度分别为714、804和627 bp。结果表明,TC-RT-PCR技术是一种简单,快捷,灵敏度高的方法,在马铃薯病毒的检测和相关基因的克隆中将会得到很好的应用。
[期刊] 华北农学报
[作者]
谷瑞华 王进忠 文思远 王升启 张爱环 魏艳敏
为了快速提取植物叶片的总RNA,并对烟草病毒进行检测,对提取及检测方法进行了研究。结果表明:以黄瓜叶片、白肋烟叶片为试材,用TRIzol试剂盒在1 h内提取到纯度高、完整性好的总RNA。设计烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的特异性引物,RT-PCR检测,从感病叶片中分别扩增出313,326,392 bp的目的片断,而健康叶片中无此扩增带。构建这3种病毒重组质粒,对核苷酸序列与GeneBank中报道的进行比较,同源性分别为99.36%,97.55%,98.21%。用这种方法快速、可靠,为烟草病毒的检测提供科学依据。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张华鹏 张剑峰 刘俊莹 王聪聪
根据PVY、PVS和PLRV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列的保守区域设计各自的引物,利用三重RT-PCR技术实现了在同一反应体系中同时扩增出3种病毒产物。PVY、PVS和PLRV扩增产物测序长度均与目的片段的长度相符,分别为781,181,364 bp;各种病毒产物的测序结果同GeneBank中的序列比对后的同源性均高达95%以上。将3种病毒的RNA稀释后进行RT-PCR,PVY、PVS和PLRV的最低检测含量分别为4.5 pg/μL～4.5 fg/μL、3.7fg/μL和4.6 fg/μL。三重RT-PCR为检测单独或复合感染PVY、PVS和PLRV的马铃薯材料,提供了一...
关键词：
马铃薯 病毒检测 三重RT-PCR
[期刊] 华北农学报
[作者]
冯丽婷 张剑峰 迟胜起
针对甘薯生产上发生为害严重的甘薯RNA病毒—甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)、甘薯G病毒(SPVG)和甘薯C病毒(SPVC),建立了多重RT-PCR检测方法。首先根据GenBank中收录的这些病毒的外壳蛋白(CP)基因的保守序列，利用Premier 5.0软件分别设计并合成了上述4种病毒的特异性引物；以4种病毒的下游特异性引物合成的cDNA为模板，在同一体系中同时加入上述4种甘薯病毒引物进行PCR扩增，初步建立这4种甘薯RNA病毒的最佳多重RT-PCR体系；通过对该多重RT-PCR体系的退火温度、延伸时间、dNTPs量、模板量、引物浓度等条件的优化，建立了能够同时检测这4种甘薯RNA病毒的最优四重RT-PCR检测体系，并对优化的多重RT-PCR体系进行了挑战测试和灵敏度测试。试验结果显示，优化的多重RT-PCR体系，各病毒引物之间不会出现交叉干扰，所扩增的4条目的条带清晰，能够明确区分上述4种甘薯病毒；挑战检测和灵敏度测试显示，此检测体系特异性强且灵敏度高。所建立的上述4种甘薯RNA病毒的多重RT-PCR检测方法能同时检测4种甘薯病毒，不仅准确灵敏，而且降低了检测成本，提高了病毒检测效率。
[期刊] 华北农学报
[作者]
曾钢 叶艳英 闫晓红 马荣才 唐乐尘 姚磊
芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)是侵染十字花科作物和观赏性物种的主要病害之一。利用反转录酶M-MLV和普通Taq酶,使用一步法多重RT-PCR技术,建立了一种快速、简便、特异性强的检测TuMV的方法。该方法简便,不需先对总RNA提纯,只需室温下在提取液中对病样叶片直接碾磨,用粗提液或浓缩后的DNA-RNA混合物为模板进行检测。2套针对TuMV的特异性引物确保了检测的准确性。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
黄广学 孟利前 朱建晨 张进 李庞博 肖海峻
在大田生产中,甘薯极易受到甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)和甘薯矮化退绿病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的混合侵染,导致甘薯产量和品质严重下降,因此构建能同时检测SPFMV和SPCSV两种病毒的检测技术体系对甘薯病毒病(sweet potato virus disease,SPVD)的预防具有重要意义。RT-PCR病毒检测技术具有灵敏度高、特异性强的优点。针对SPFMV和SPCSV病毒分别设计4对和3对特异性引物,通过单一RT-PCR检测技术筛选出特异性强的引物和最佳退火温度;在双重RT-PCR检测体系中,针对SPFMV和SPCSV两种病毒的引物浓度组合设置5个处理,优化双重RT-PCR病毒检测技术体系。单一RT-PCR检测结果表明,SPFMVS2/A2和SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为461bp,对于SPCSV病毒来说,SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为304bp,最佳退火温度为56℃;在双重RT-PCR检测技术体系中,SPFMV/SPCSV的引物组合浓度比为1∶3时,目标片段扩增效果最好。对两种病毒最低检测浓度的测试结果表明,SPFMV和SPCSV两种病毒RNA的最低检测浓度相当于模板RNA浓度的10-4μL。双重RT-PCR检测技术体系的构建,为大田生产中受SPFMV和SPCSV共侵染的甘薯病毒病的预防提供技术支持。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
侯义宏 林祥梅 张晓臣 朱中武 贾广乐 梅琳 吕建强 钱永华 韩雪清
为了建立简便、快速的AIV检测方法,根据禽流感病毒H5、H7、H9亚型HA基因和N1亚型NA基因的保守序列,设计了4对RT-PCR引物,对H5、H7、H9、N1 4个亚型进行了多重RT-PCR扩增,通过多重RT-PCR敏感性和特异性试验,建立了多重RT-PCR检测方法;应用所建立的多重RT-PCR方法和病毒分离的经典方法对395份(4省20多个地区)口岸检样进行了平行检测,并对其检测结果进行了比较。结果表明,H5、H7、H9、N1 4个亚型的扩增产物大小分别为380,641,493和328 bp,对NDVI、BV、ARVI、BDV、MDV、FPV扩增均为阴性,平行检测结果完全吻合,说明所建立的...
关键词：
禽流感 病毒检测 多重RT-PCR
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
潘晓艺 刘杜鹃 沈锦玉 张宇飞 蔺凌云 王军毅 郝贵杰 姚嘉赟 徐洋 袁雪梅
罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)和双顺反子病毒(M.rosenbergii dicistrovirus,MrDV)是已报道对罗氏沼虾易感的主要致病性病毒,该研究通过建立双重RT-PCR方法对MrDV和MrNV两种病毒同时进行检测。根据MrDV和MrNV基因组序列的保守区分别设计特异性引物,并对双重PCR的退火温度和引物浓度进行优化,在获得优化反应体系和反应条件后,对罗氏沼虾样品进行检测。结果表明,双重PCR最佳退火温度为60℃,反应体系最佳引物终浓度MrNV384为0.1μmol/L,MrDV472为0.05μmol/L,对...
[期刊] 林业科学
[作者]
胡小燕 陈莉 辛海波 连青龙 义鸣放
根据黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对,运用单重RT-PCR检测到病毒并筛选出适合多重RT-PCR的引物对。以唐菖蒲18S rRNA为内参照,建立同时检测CMV和TMV的多重RT-PCR方法。此方法可从带病样品中扩增出CMV(629bp)和TMV(423bp)2条特异片段。测序结果表明:CMV扩增产物与其他植物分离物核苷酸的同源性为93%～97%,TMV扩增产物与其他分离物核苷酸的同源性可达99%。
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