NPR1(Non-expresser of pathogenesis related genes 1)是水杨酸(Salicilic acid,SA)介导的系统获得抗性(Sys-temic aquired resistance,SAR)的关键调控因子,在水稻中过量表达拟南芥NPR1和水稻NH1/OsNPR1(NPR1 homo-logue 1)(NPR1的同源物)可增强抗病性。水稻基因组中还有4个NPR1旁系同源物(Paralog),为NH1的家族蛋白。本试验利用双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC,or split YF...

【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶片组织,激光共聚焦显微镜下观察SSⅠ和PPDK1相互作用产生的荧光信号。【结果】双酶切试验鉴定表明,326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1重组载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;双分子荧光互补试验中,可观测到SSⅠ和PP-DK1相互结合而产生...

【目的】解析玉米淀粉合成限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase-bt2)与糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPN1)在植物体内是否存在相互作用。【方法】首先克隆获得AGPase-bt2和GPN1基因,然后采用双分子荧光互补技术(BiFC),构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-GPN1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,并用2种载体共同瞬时侵染烟草叶肉细胞,48h后在激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2与GPN1的相互作用。【结果】AGPase-bt2基因长1 428bp,GPN1基因长1 497bp。双酶切鉴定结果表明,326-CYCHA-...

【目的】解析玉米淀粉合成限速酶ＡＤＰ－葡萄糖焦磷酸化酶（ＡＧＰＡｓｅ－ｂｔ２）与糖酵解关键酶甘油醛－３－磷酸脱氢酶（ＧＰＮ１）在植物体内是否存在相互作用。【方法】首先克隆获得ＡＧＰＡｓｅ－ｂｔ２和ＧＰＮ１基因，然后采用双分子荧光互补技术（ｂｉＦＣ），构建３２６－ＣＹＣＨＡ－ＡＧＰＡｓｅ－ｂｔ２和３２６－ＣＹＮｅｅ－ＧＰＮ１双分子荧光表达载体，转化农杆菌ｅＨＡ１０５，并用２种载体共同瞬时侵染烟草叶肉细胞，４８Ｈ后在激光共聚焦显微镜下观察ＡＧＰＡｓｅ－ｂｔ２与ＧＰＮ１的相互作用。【结果】ＡＧＰＡｓｅ－ｂｔ２基因长１ ４２８ｂＰ，ＧＰＮ１基因长１ ４９７ｂＰ。双酶切鉴定结果表明，３２６－ＣＹＣＨＡ－．．．

【背景】PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分,在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用。前期利用酵母双杂交技术(Y2H)筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白,获得多聚胞嘧啶结合蛋白1(poly(r C)-binding protein 1,PCBP1)。【目的】探索PCBP1蛋白与流感病毒PA蛋白的互作关系及其对流感病毒复制的影响,为深入理解流感病毒在宿主体内的复制调控机制提供数据。【方法】将诱饵质粒pGBKT7-PA与筛选到的重组质粒p GADT7-PCBP1以及阴性对照组和阳性对照组按照醋酸锂法分别共转化酵母感受态细胞,并涂布在3种营养缺陷型培养基上,30℃倒置培养5—7 d,观察酵母菌落生长情况和菌落颜色,回交验证PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中的相互作用。参照GenBank中录入的PA蛋白和人源PCBP1蛋白的序列,分别设计特异性扩增引物,构建真核重组表达质粒pCAGGS-Flag-PA和pCAGGS-Myc-PCBP1,将这两种真核表达质粒分别单独转染或共同转染HEK293T细胞,于转染48 h后裂解细胞,收获上清,留取少部分作对照,余下的样品逐步加入FLAG单抗和Protein G琼脂糖珠子进行免疫共沉淀(Co-IP),经SDS-PAGE和Western blot检测PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用。利用慢病毒包装系统pLVX-IRES-Zs Green1在HEK293T细胞中包装假病毒,将假病毒侵染A549细胞后经超速流式分选构建PCBP1蛋白过表达细胞系,Western blot检测PCBP1过表达情况,然后用流感病毒WSN以0.01 MOI感染该过表达细胞系,于感染后24和48 h收获上清,对上清中的流感病毒进行蚀斑计数。合成PCBP1蛋白的si RNA,转染A549细胞下调PCBP1蛋白的表达,干扰后48 h通过Western blot检测PCBP1蛋白表达下调情况,并以MOI=0.01感染流感病毒WSN,收获感染后24和48 h的上清,进行蚀斑滴定计数。【结果】通过酵母回交验证发现诱饵质粒pGBKT7-PA与重组阳性质粒p GADT7-PCBP1的共转酵母菌落可以在SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A等3种营养缺陷型平板上正常生长,并且能分解底物X-α-Gal,使菌落呈现蓝色,与阳性对照组一致,表明PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中存在相互作用。免疫共沉淀试验发现PA蛋白可以将PCBP1蛋白沉淀下来,说明PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用。在PCBP1过表达细胞系中,PCBP1蛋白表达水平显著提高,流感病毒的复制滴度下降;而通过si RNA干扰后,PCBP1表达水平显著下降,流感病毒的复制滴度升高,表明PCBP1对流感病毒复制具有负调控作用。【结论】通过研究发现流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在相互作用,且宿主蛋白PCBP1对流感病毒的复制具有负调控作用。

采用荧光光谱法研究了烟酸(NTA)与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用.结果表明,NTA主要以动态猝灭的方式使BSA的内源性荧光下降.通过计算得出了在测定温度(T)为293和310 K时,NTA与BSA的结合常数(KA)分别为31.9和72.9 L·mol-1.根据热力学参数确定了NTA与BSA之间以疏水力相互作用.同步荧光光谱与紫外光谱技术分析表明,NTA对BSA的构象几乎没有影响.

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,对其根瘤菌共生信号转导途径和作用机制的研究,有助于揭示根瘤菌与豆科植物共生关系建立和共生体形成的奥秘。本研究利用酵母双杂交系统和体外蛋白质相互作用技术,证明百脉根GARS类家族转录因子结瘤信号通道蛋白NSP1和NSP2在体外体内均可以相互作用,并将相互作用的位点定位在NSP1的GRAS结构域的LHRII区域和NSP2的LHRI区内。

【目的】研究拟南芥开花抑制因子TFL1与2个GRFs家族成员GRF4和GRF7之间的互作关系,为进一步解析TFL1抑制植物开花的分子机制奠定基础。【方法】以拟南芥cDNA作为模板,利用基因特异性引物,克隆TFL1、GRF4和GRF7,分别连接入门载体pCR8,经菌落PCR扩增和测序鉴定分别获得这3个基因的入门载体TFL1-pCR8、GRF4-pCR8和GRF7-pCR8。利用LR重组的方法将上述3个入门载体分别与目标载体pGADT7和pGBKT7重组获得酵母双杂交试验载体TFL1-BD、GRF4-AD和G

寨卡病毒(Zika Virus)属于黄病毒科中的黄病毒属,虽然很早就已经被人类所发现,但是一直到2015年在南美巴西的大规模爆发,才引起了广泛的关注.寨卡病毒对人类的感染往往引起包括小头畸形和格林-巴利综合征在内的多种症状.寨卡病毒的基因组为单链正链RNA,其基因组可以编码翻译并剪切加工出3个结构蛋白,分别为膜蛋白,囊膜蛋白和核衣壳蛋白,以及7个非结构蛋白(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5).相关研究已经证明,NS1蛋白与同属黄病毒属的登革病毒的发病有紧密的联系,而且根据其蛋白结构推测其可能与寨卡病毒穿越血脑屏障有关.因此鉴别NS1与细胞内的相互作用蛋白对于发现寨卡病毒在细胞内的转运,转录,以及装配都有重大的意义.在此,该课题构建并在HEK293细胞中表达包含Flag和Strep两种标签的NS1融合蛋白,通过免疫沉淀的方法将与NS1结合的蛋白利用标签蛋白进行分离,利用高分辨生物质谱技术,对蛋白进行分析鉴定.通过分别带有Flag与Strep标签的相互作用蛋白分析,发现了16个两种标签共同的结合蛋白,其进一步的通路分析证明这些蛋白于与病毒转录、病毒复制和免疫反应多个通路有关,相关的研究结果为今后进一步研究寨卡病毒的复制机制以及开发抗病毒药物提供了重要的参考价值.

【目的】HSP60是热休克蛋白中重要的一员,在昆虫先天性免疫过程中起重要作用,同时也是昆虫生长发育的必要因子。前期研究证明家蚕BmHSP60参与家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵细胞过程,本研究通过鉴定BmHSP60相互作用蛋白,为其在家蚕先天性免疫中作用机制研究打下基础。【方法】利用免疫共沉淀和银联-质谱分析技术(LC-MS/MS),首先构建BmHSP60过表达载体并融合Flag标签,转染到家蚕细胞中48 h后,收集蛋白,进行免疫共沉淀,用Flag抗体孵育磁珠调取相互作用蛋白,银染处理后,能够检测到明显的差异条带,把差异条带切胶保存在-80℃,然后质谱分析差异条带的多肽;根据质谱结果和差异条带的大小与NCBI数据库进行比对,筛选到候选相互作用蛋白。最后,构建候选相互作用蛋白的克隆载体并融合HA标签,分别和BmHSP60表达载体共转到家蚕细胞,免疫共沉淀和荧光共定位验证BmHSP60和候选蛋白之间的相互作用。并通过Mito-Tracker-Green分析BmHSP60候选相互作用蛋白与线粒体的共定位。【结果】免疫共沉淀银染结果显示BmHSP60相互作用蛋白在110、90、75、60和35 kD附近有5条明显的差异条带,将这5条条带混成蛋白池进行质谱分析,通过银联-质谱分析结果和家蚕基因组数据库以及NCBI数据库进行比对分析共鉴定到32个差异蛋白,根据多肽数量和蛋白分子量的大小共筛选到5个相互作用候选蛋白与银染结果差异条带一致,分别为ADP/ATP translocase(ANT)、Actin、Alpha-tubulin、Elongation factor 1-alpha(EF1α)和HSP90。构建BmHSP60候选相互作用蛋白克隆表达载体并融合HA标签,与BmHSP60共同转染到家蚕细胞,免疫共沉淀immunoprecipitated(IP)用α-Flag抗体孵育,immunoblotting(IB)再用α-Flag抗体孵育,均能够检测到BmHSP60表达。而IB用α-HA抗体孵育显示只有BmANT和BmHSP90能够检测到相应的条带,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有检测到相应的条带,说明只有BmANT和BmHSP90与BmHSP60具有直接的相互作用,而Alpha-tubulin和EF1α与BmHSP60没有相互作用。通过荧光共定位进一步分析表明BmANT和BmHSP90能够与BmHSP60共定位在细胞质中。线粒体标记物Mito-Tracker-Green共定位结果显示BmHSP60、BmANT和BmHSP90均能够与线粒体共定位到一起。【结论】鉴定到家蚕热休克蛋白BmHSP60能够与BmANT和BmHSP90相互作用,并共定位于线粒体,可用于研究BmHSP60在家蚕抗病毒免疫中的作用机制。

[目的]为了开发氟雷拉纳（Fluralaner，FLU）新剂型，本研究以酪蛋白胶束（Micellar Casein，MC）为载体，研制了MC-FLU粉末制剂。[方法]采用pH驱动法制备了MC-FLU自组装复合物，并在pH为10.0和7.0的条件下制备了MC-FLU的碱性和中性复合物，分析了不同复合物中MC与FLU的作用机理；经冷冻干燥和喷雾干燥制得MC-FLU复合物粉末，采用扫描电镜（SEM）等手段表征了复合物结构，测定了复合物的溶解性，并评价了复合物的模拟胃肠消化特性。[结果]三种pH下MC与FLU相互作用的热力学参数ΔG<0，ΔH<0，ΔS<0。298 K下，自组装复合物中FLU与MC的结合常数为2.25×10~(6) L·mol~(-1)，中性复合物中二者结合常数为2.12×10~(5) L·mol~(-1)，碱性复合物中结合常数为2.26×10~(4) L·mol~(-1)。中性复合物粒径约为200 nm，碱性复合物粒径约为120 nm，自组装复合物粒径随着FLU添加量的增加而显著增大。三种条件下复合物Zeta-电位均小于零。SEM观察发现，喷雾干燥法制得的中性复合物粒径最小。[结论]不同pH下MC与FLU的主要作用为氢键和范德华力，且结合过程为自发过程；其中，自组装复合物中FLU与MC的结合常数最大。冷冻干燥法制得的复合物溶解性高于喷雾干燥样品。模拟胃肠消化试验结果表明，经MC负载后，FLU的累积释放率显著降低。研究结果可为FLU新载体的开发及MC在药物分子负载中的应用提供参考依据。

[目的]本文旨在通过姜黄素与大豆7S、11S蛋白质结合后,溶于天然低共熔溶剂(NADES)以改善姜黄素水溶性低、稳定性差的缺陷,并揭示姜黄素与蛋白质的相互作用机制。[方法]将姜黄素与实验室自提大豆7S、11S蛋白结合,确定姜黄素与蛋白质结合的最优条件;将结合物溶于制备的6种NADES中,考察结合后姜黄素的光、热稳定性;通过傅里叶变换红外光谱分析结合后姜黄素对蛋白质的结构影响并采用荧光光谱法分析二者之间的相互作用机制。[结果]与大豆7S、11S蛋白结合后的姜黄素在NADES中的光、热稳定性均有所提高。姜黄素与大豆7S、11S蛋白的结合强度均较弱,且姜黄素与大豆7S、11S蛋白间为静态猝灭,生成了摩尔比约为1∶2的不发光的复合物,同时,姜黄素与蛋白质的结合引起蛋白质部分二级结构的展开与折叠。[结论]姜黄素与大豆7S、11S蛋白的相互作用可以改善姜黄素水溶性低、稳定性差的缺陷,且制备的蛋白质材料可能被用作新型药物载体。

采用荧光光谱法和紫外光谱法研究了5种二价金属离子与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用,通过生物大分子猝灭反应机制和结合位点模型研究发现锌离子Zn2+,镍离子Ni2+,钴离子Co2+和钙离子Ca2+均可导致牛血清白蛋白内源荧光猝灭,Zn2+,Ni2+和Co2+离子半径处在正常范围,能有效进入牛血清白蛋白结合位点与牛血清白蛋白结合形成超分子配合物,使牛血清白蛋白的二级结构发生改变,主要表现为静态猝灭。Ca2+离子半径较大,受空间位阻影响不能有效进入结合位点对BSA二级结构影响较小,不能与BSA形成配合物,表现为动态猝灭;而Mg2+由于大的水合半径阻碍了Mg2+与牛血清白蛋白的有效碰撞,使电子或能量的...

为研究大炎肽影响胰腺β细胞的机制,将大炎肽偶联到CNBr活化的Sepharose 4B亲和层析介质上,利用亲和纯化的方法垂钓其在胰腺组织中的相互作用蛋白,并对纯化蛋白进行胰蛋白酶水解,测定水解片段的分子质量和其中2个片段的氨基酸序列,在MASCOT数据库中检索,鉴定此蛋白为胱硫醚β-合成酶,结果提示大炎肽可能通过结合胱硫醚β-合成酶,调节其活性,造成同型半胱氨酸积累。

以豆科植物百脉根为材料,构建了AD-cDNA表达文库。其库容量达到每3μg DNA 2×106酵母转化子,空载率为12.5%,平均片段长度为1.5 kb。以百脉根结瘤因子受体激酶基因1(nod factor receptor kinase,NFR1)蛋白激酶结构域的DNA片段(NFR1-PK)为诱饵,利用酵母双杂技术,筛选与NFR1相互作用的基因。结果在含X-gal的四缺选择性培养基上筛选到120个克隆。经质粒抽取、PCR鉴定、回转酵母验证得到80个阳性克隆。对26个确定阳性克隆的外源片段进行测序和同源性分析,通过NCBI数据库比对分析鉴定含有JAB1、AT-RICH结构域等4个与NFR1-P...