为在噬热栖热菌(Thermusthermophilus)中开収无需筛选标记的基于双交换同源重组的基因无痕敲除手段,以大质粒及染色体上的TTP0042与TTC0340_0341为靶基因,构建含有其两侧同源臂的基因敲除载体幵转化T.thermophilusHB27细胞,将转化混合物涂布于不含筛选物质的培养基上,通过PCR及Southern杂交检验转化子的基因型。结果表明,采用线状的TTP0042基因敲除载体迚行转化,获取表观Δ0042突变体的概率为10–4,而使用闭合环状载体,该概率可达10–3;基因型及表现型分析显示,这些表观Δ0042均为TTP0042无痕敲除型突变体。该敲除手段在染色体上的基因TTC0340_0341中得到验证,从300个单菌落中成功鉴定出了1个Δ0340_0341突变株。

【目的】利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌(Valsa mali)中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体,通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能,为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础,并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。【方法】通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1(暂命名),该基因在接种5 d后,在病组织中表现出一定的上调表达,推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法,将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷...

以菜豆晕疫病菌(Pseudomonas syringae pv.phaseolicola)NPS3121株系为出发材料,根据Gen Bank中登录的1448A甘油激酶(glycerol kinase,GK)氨基酸序列设计同源引物,通过PCR克隆NPS3121 GK基因,序列全长为1 506 bp,可编码1条含501个氨基酸的多肽。生物信息学分析表明,NPS3121 GK包含469个氨基酸,相对分子质量为55 800,富含α–螺旋结构,等电点为5.44。通过整合突变的方式构建了NPS3121 GK敲除突变体,敲除突变体与野生型相比,在M9培养基中生长速率降低18%,在KBM培养基中生长速率降低16%。敲除突变体中甘油浓度较野生型提高了6倍。

【目的】通过同源重组技术敲除嗜线虫致病杆菌（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）Ｙｌ００１中ｃｐＸｒ基因，为进一步研究ｃｐＸｒ调节子调控抗菌物质产生的机理奠定基础。【方法】通过融合ｐｃｒ技术，将ｃｐＸｒ基因的上、下游同源片段及质粒ｐＪｃＶ５３上的卡那抗性基因Ｋｍｒ ３个片段连接，克隆到自杀载体ｐｄｍ４中，将重组质粒转化到大肠杆菌ｓ１７－１λｐｉｒ中，经接合转移导入嗜线虫致病杆菌内，通过同源重组敲除ｃｐＸｒ基因；采用琼脂扩散法和抑制菌丝生长速率法分别测定突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用。【结果】从Ｘ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ Ｙｌ００１基因组中成功敲除ｃｐＸｒ基因，得到了．．．

【目的】获得敲除肌肉生长抑制素(MSTN)基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建:以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5382bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250μg·ml-1G418筛选7d,再用200μg·ml-1G418+2μmol·L-1GANC维持筛选...

【目的】为探明PpCASLUU3是否参与灰霉菌引起的小立碗藓中类过敏反应,构建PpCASLUU3-PTN182敲除载体,对早期登陆植物防卫防御的进化提供依据。【方法】根据同源重组的原理,以小立碗藓基因组DNA为模板,利用Primer 5设计的引物,扩增得到小立碗藓PpCASLUU3基因的上、下游同源臂基因片段。将上下游同源臂基因分别克隆到pMD-19T上,测序验证,使用EcoR I、EcoR V酶切含上游目的基因的pMD-19T获得上游目的基因片段,使用BamH I、Sma I酶切含下游目的基因的pMD-19T获得下游目的基因片段,同时酶切PTN182载体,经T_4-DNA连接酶连接,转入大肠杆菌感受态,筛选出阳性克隆,采用相同的方法,将下游臂连入PpCASLUU3.1-PTN182载体。【结果】经PCR检测、酶切验证,获得了完整的PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2敲除载体。经测序分析,插入序列PpCASLUU3.1和PpCASLUU3.2与未插入前相似度分别为100%和99.63%。【结论】PpCASLUU3-PTN182敲除载体构建成功。

从鸡B淋巴DT40细胞系中克隆-βactin启动子,替换pCDNA3.1(+)载体中的SV40启动子,构建-βactin启动子驱动的Neomycin抗性基因表达框。将克隆的sIgMλ轻链基因两侧各约2 kb的序列插入到抗性表达框的两侧作为同源臂。PCR、酶切以及测序结果表明成功构建了靶向sIgMλ轻链基因的置换型打靶载体pCDNA-act-neo-HR。为建立sIgMλ轻链基因敲除的DT40细胞模型,探究sIgMλ轻链在IBDV感染DT40细胞过程中的作用奠定了基础。

为了研究催化活性半胱氨酸Ｃｙｓ１５４、Ｃｙｓ１５８残基对小麦细胞质甘油醛－３－磷酸脱氢酶（Ｔａ ＧａＰＣ）蛋白酶活性的影响，利用重叠延伸ＰＣＲ法分别将这２个位点的半胱氨酸突变成丝氨酸，并分别连入Ｐ ＥＴ２８ａ（＋）原核表达载体。在２５℃条件下，Ｔａ ＧａＰＣ及其定点基因Ｔａ Ｃｙｓ１５４ｓ／Ｔａ Ｃｙｓ１５８ｓ经０．２５ ｍｍｏｌ／ｌ ＩＰＴＧ诱导后高效表达，ｓＤｓ－ＰａＧＥ电泳检测结果显示，目标重组蛋白均为可溶性且大小约为４０ ｋ Ｄａ，与预测结果一致。在此基础上，经超声波破菌及镍柱纯化获得３种纯化重组蛋白。这为后续Ｔａ ＧａＰＣ及其定点突变体蛋白酶活性测定及活性位点分析提供试验材料。

【目的】构建两套用于牛肌肉生长抑制素(myostation,MSTN)基因敲除的置换型打靶载体。【方法】设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)以牛耳皮肤组织基因组DNA为模板分别扩增出两套打靶载体的同源短臂和长臂,再分别插入到两套打靶专用基础载体pMCS-PLP和PⅢ中,构建两套用于牛MSTN基因敲除的置换型打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN。【结果】经过PCR、T载体连接和DNA测序,证实载体pPLP-MSTN包含2.8 kb同源短臂和4.0 kb同源长臂,载体PⅢ-MSTN包含1.3 kb同源短臂和...

【目的】探索重叠延伸PCR法在昆虫化学感受蛋白基因点突变上的应用,研究半胱氨酸(Cys32)对小菜蛾(Plutella xylostella)化学感受蛋白1(PlxyCSP1)结合特性的影响。【方法】用计算机软件模拟PlxyCSP1上Cys32突变前后的蛋白三级结构以及与配体化合物的结合情况,确定点突变位点。根据扩增得到的PlxyCSP1序列设计并合成重叠引物,利用重叠延伸PCR法,将PlxyCSP1上的Cys32突变成色氨酸(Trp32),获得突变体PlxyCSP1-M。将突变后的基因与载体pET-32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】分子对接图显示,配体可以顺利进入Pl...

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的拟轮枝镰孢ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠(cefotaxime sodium,Cefo)和氨苄青霉素钠(ampicillin sodium,Amp)对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B(hygromycin B)的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性基因(HPH)的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150μg·mL~(-1)时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150μg·mL~(-1)时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP(登录号:LC420351.1)的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。

青鳉是研究基因功能、器官发生和发育机制的模式生物之一，基因编辑技术已在青鳉中得到广泛应用，但利用CRISPR/Cas9技术构建青鳉突变体的详细过程还未见报道。为了完整详细地阐明青鳉突变体的构建过程，本研究以青鳉Olpax6.1基因的敲除为例，首先利用ChopChop网站设计获得Olpax6.1基因gRNA的靶点；其次通过PCR扩增和质粒酶切分别获得gRNA和Cas9mRNA体外转录的模板并通过体外转录合成gRNA和Cas9mRNA；再者将Cas9mRNA和gRNA混合进行青鳉胚胎显微注射获得突变F_(0)；最后利用PCR、T7EndonucleaseI酶切和Sanger测序筛选F_(0)与野生型杂交的子代获得相同突变类型的F_(1)，进而将相同突变的F_(1)进行杂交并筛选其子代获得了青鳉Olpax6.1 敲除的纯合突变体，纯合突变体表现出眼部发育畸形的经典表型。本研究为青鳉突变体的构建提供详细完整的实验方案，同时也为其他鱼类突变体的构建提供技术参考。

［目的］为了进一步研究黄瓜基因的功能，本文构建了黄瓜Ｔ－ＤＮＡ插入突变体库。［方法］以黄瓜栽培品种‘长春密刺’子叶节为转化外植体，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将Ｔ－ＤＮＡ插入突变载体ｐＲＯＫ２后转化黄瓜；通过筛选压力梯度试验，确定遗传转化体系最适合的卡那霉素（ＫＡＮ）筛选浓度；使用ｐＣＲ检测和斑点杂交方法鉴定Ｔ０和Ｔ１代转化植株；以‘长春密刺’植株为对照，统计Ｔ１代植株表型。［结果］确定１００ ｍｇ·Ｌ－１为最适合的ＫＡＮ抗性芽筛选浓度。Ｔ０代植株ｐＣＲ检测结果初步证明，ｐＲＯＫ２成功整合到１４Ｓ１和１４Ｓ２两个Ｔ０代株系基因组中。１４Ｓ１自交后获得５５个Ｔ１代单株，对其进行ｐＣＲ检测，发现．．．

在鱼腥蓝细菌PCC 7120中,all3555是一个乙酰羟酸合成酶的编码基因,为研究该基因在鱼腥蓝细菌PCC 7120的生长和环境适应过程中的作用,构建了该基因的超表达和缺失突变菌株,结果显示该基因缺失后鱼腥蓝细菌PCC 7120仍可继续生长,但对NaCl胁迫的敏感性有一定程度提高,而超表达该基因则会提高鱼腥蓝细菌PCC 7120对氧化胁迫和NaCl胁迫的抗性,表明all3555对鱼腥蓝细菌PCC 7120的正常生长影响较小,但对菌株的抗氧化胁迫和抗NaCl胁迫等有重要作用。

以改造合成的5个Bt基因(cry1C*、cry2A*、cry1Ab、cry1Ac和cry9C*)为材料,利用DNAshuff-ling的体外分子进化技术构建1个含有1 000个重组基因克隆的大肠杆菌表达库;通过诱导表达重组蛋白,ELISA方法测定蛋白表达量,以棉铃虫(Helicoverpa armigera)为试验昆虫进行毒性试验。结果显示:重组克隆的蛋白毒性与阳性对照Cry1Ac相比,增强的有122个,持平的有38个,有毒性但毒性降低的有232个,失去毒性的有608个;对这1 000个重组克隆进行了测序,比较了重组基因与原始基因的序列同源性,除去55个克隆未能找到其原始基因来源,将其余的94...