基于接种华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)7653R的紫云英(Astragalus sinicusL.)感染根与未接种对照根在转录水平上的差异,利用抑制差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),建立了紫云英结瘤固氮过程中的差异表达cDNA文库,共获得527个有效克隆,其中增强或特异性表达的上调文库中包含341个克隆,抑制表达的下调文库包含186个克隆。对其中的1个上调表达cDNA克隆AsB6利用RACE(rapid amplification of cDNAends)方法获得了其基因全长序列,利用BLAST在线...

将紫云英根瘤中特异表达的编码ＣＣＰｓ（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）同源多肽的蛋白ＡｓＦ２５９在大肠杆菌表达菌株（ＤＨ１０Ｂ）中进行体外诱导表达，分别检测其在洋葱表皮细胞与紫云英根瘤中的细胞定位，并利用免疫荧光技术，检测紫云英中ＡｓＦ２５９基因的时空表达特征。结果表明：ＡｓＦ２５９蛋白分布于洋葱表皮的细胞壁、细胞膜、细胞质；基因表达和融合蛋白定位实验显示，ＡｓＦ２５９在根瘤中呈特异性表达，在类菌体分化前期大量表达，且ＡｓＦ２５９蛋白与类菌体共定位，表明ＡｓＦ２５９基因属于ｎＣｒ家族，在类菌体分化、维持和共生固氮过程发挥重要作用。

利用酵母双杂交技术,以结瘤受体激酶(NORK)蛋白的跨膜结构域(TM)为诱饵,进行了与其相互作用靶蛋白的筛选鉴定。结果获得41个候选阳性克隆,通过测序和在NCBI中进行Blast比对分析,发现其中一个具有重要生物学功能的互作蛋白翻译延伸因子AsEF1-α,并将该蛋白相应的编码基因命名为AsEF1-α。进一步的验证表明靶蛋白AsEF1-α与诱饵互作的关键结构域是EF1-α-Ⅲ。

采用实时荧光定量PCR技术,研究了紫云英共生表达的非特异性转脂蛋白编码基因AsE246和AsIB259在根瘤发育和固氮过程中的组织和时空表达特征,并初步考察了其在重金属镉胁迫条件下表达水平的变化。结果表明:2个目标基因仅在紫云英根瘤中特异表达,并且均在接种华癸中慢生根瘤菌7653R后22 d左右表达量达到最高。在低浓度重金属镉胁迫条件下,AsE246和AsIB259在处理早期的表达量明显升高。在低或高镉胁迫条件下,在处理中期其表达量均显著低于正常根瘤,在处理后期则维持在较低水平,表明它们参与紫云英应对镉胁迫的应答机制。

利用紫云英（ＡｓｔｒａｇａｌｕｓｓｉｎｉｃｕｓＬ．）种子浸提物诱导紫云英根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｈｕａｋｕｉｉ）野生型菌株７６５３Ｒ产生结瘤因子（ＮｏｄＲｈ）。根毛卷曲试验表明，ＮｏｄＲｈ能诱导产生各种形式的根毛变形、卷曲和分枝，并且能诱导形成典型的“牧羊拐”状卷曲，与菌体正常侵染所引起的变化相同。同时发现，相对较高浓度的结瘤因子ＮｏｄＲｈ能抑制根的生长，形成粗短根。在制备紫云英根瘤菌接种剂的过程中，利用种子浸提物诱导产生结瘤因子，能显著提高根瘤菌的侵染结瘤能力。

对紫云英根瘤菌７６５３Ｒ基因文库的５个重组质粒，即ｐＮＲ１０２，ｐＮＲ１０３，ｐＮＲ１０８，ｐＮＲ２０３，ｐＮＲ２１３进行各种内切酶的酶切分析。结果证实它们均含有１．７ｋｂ的ＥｃｏＲⅠ－Ｂｇ１Ⅱ双酶切片段和１．９ｋｂ的ＥｃｏＲⅠ－ＳａｃⅠ双酶切片段，而ｐＮＲ２１３的外源片段最大，包含有其余质粒所具有的各种片段。以ｐＮＲ１０８的外源片段作探针，进行ＤＩＧ杂交，发现探针与其余４个重组质粒的外源片段有强的同源杂交；与７６５３Ｒ的内源质粒杂交还表明，ｐＮＲ１０８的外源片段来源于共生质粒ｐＲａ７－２。

【目的】分析不同外源有机物料(稻草、葡萄糖)及氮素投入对紫云英季土壤固氮微生物的调控作用,为我国南方紫云英-水稻轮作体系中秸秆还田及化肥减施增效提供支持。【方法】采用盆栽试验,共设7个处理,即CK(对照,不添加有机物料和氮)、稻草等量添加并配施不同量氮素(分别表示为Rs、RsN1和RsN2,对应C/N比分别为66、25和13);等秸秆碳量添加葡萄糖并配施不同量氮素(即Glc、GlcN1、GlcN2)、调整C/N比与秸秆添加相应处理保持一致。采集紫云英快速生长期土壤样品,利用Illumina Miseq PE300高通量测序和绝对定量PCR技术分析固氮功能基因nifH及固氮微生物群落特征。【结果】单独添加外源秸秆或葡萄糖处理的土壤C/N与对照无明显差异,但增施氮肥后C/N比呈下降趋势,GlcN2处理土壤C/N显著低于对照;对于土壤速效养分,Rs和RsN1处理土壤NO3--N含量与CK类似,但RsN2处理明显增加了60%;而添加葡萄糖处理土壤NO3--N含量整体较高(增幅为35%—79%);稻草单独添加或与氮素配施对土壤速效磷含量无明显影响,添加葡萄糖处理则显著降低其含量,降幅为16%—24%,但不同氮水平之间无明显差异。不同处理土壤nifH基因拷贝数为80.4×106—140.5×106 g-1土,稻草和葡萄糖添加处理nifH基因拷贝数较CK呈增加趋势,而增施氮素后有所下降。外源碳、氮添加导致固氮微生物α-多样性较CK整体降低,但α-多样性对氮素的响应因碳源种类而异,即稻草添加后增加氮素供应(RsN1和RsN2)处理土壤固氮微生物物种数目和Chao 1指数较Rs显著降低,降低幅度分别为6%—11%和13%—15%,而添加葡萄糖后增施氮肥则对α-多样性有一定促进作用。PCoA结果显示土壤固氮微生物群落结构主要因碳源种类差异而聚集为不同组别,受氮水平供应的影响相对较小。属水平上不同物种对外源碳、氮添加的响应存在明显差异:慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)相对丰度最高,而外源碳、氮添加后较CK明显降低,且稻草添加处理的降低幅度(12.3%—19.7%)小于葡萄糖添加处理(31.6%—40.5%);第二优势菌属(地杆菌,Geobacter)对碳源添加的响应趋势与Bradyrhizobium相反,与CK相比,葡萄糖添加处理Geobacter相对丰度的增加幅度(170%—270%)明显大于秸秆添加处理(25.0%—54.6%)。同时,多元回归树、RDA及相关性分析表明土壤固氮微生物丰度、多样性和群落结构组成主要受土壤NO3--N和速效磷的影响较大。【结论】氮素供应对固氮微生物多样性和群落结构的调控作用受碳源种类(或秸秆和葡萄糖中碳源有效性差异)影响;同时,不同碳源添加后造成土壤速效磷含量的差异也可能是影响紫云英季土壤固氮微生物群落组成的重要环境因子。

将紫云英AsIB259基因编码的一个预测的非特异性转脂蛋白AsIB259(nsLTP,non-specific lipid transfer protein)在大肠杆菌表达菌株Rosetta 2(DE3)中进行了诱导表达,体外测定AsIB259蛋白的脂质结合动力学特征,检测它对不同碳链长度脂肪酸及其衍生物的结合能力,进一步考查AsIB259超表达对紫云英毛根结瘤情况的影响。结果表明:AsIB259具有转脂蛋白的典型特征,与16~22碳链长度脂肪酸的结合活性较强,对茉莉酸也表现出一定的结合活性;AsIB259超表达导致根瘤数量增加1.5倍且固氮酶活性降低,说明该基因在根瘤形成和固氮过程中发挥重要...

将豌豆根瘤菌共生质粒pJB5JI导入紫云英根瘤菌含共生质粒的7653R菌株和消除了共生质粒的7653R+1菌株中。7653R+1接合子获得了在碗豆上结瘤的能力,7653R接合子却不能在豌豆上结瘤。从而揭示出紫云英根瘤菌的共生质粒能抑制导入的豌豆根瘤菌共生质粒pJB5JI功能的表达。同时pJB5JI的导入使7653R接合子在其正常宿主紫云英上的结瘤固氮能力较亲本7653R显著提高。试验同时考察了pJB5JI导入紫云英根瘤菌后的稳定性。

将碗豆根瘤菌共生质粒ｐＪＢ５ＪＩ导入紫云英根瘤菌７６５３Ｒ及其消除了共生质粒的突变株７６５３Ｒ＋１。两种类型转移接合子在人工合成培养基上繁殖时，ｐＪＢ５ＪＩ能稳定存在，但从它们在碗豆或紫云英上所结根瘤的分离物中，只有部分检测到ｐＪＢ５ＪＩ。以转座子Ｔｎ５及首蓿根瘤菌ｎｏｄ基因为探针，对未检测到ｐＪＢ５ＪＩ质粒的根瘤分离物７６５３ＲＡ９及７６５３Ｒ＋１Ｐａ，进行ＤＮＡ同源性分析，结果表明ｐＪＢ５ＪＩ质粒并没有全部丢失，很可能全部或部分整合到了受体紫云英根瘤菌的染色体中。

总结了紫云英根瘤菌分子遗传学研究进展。这类根瘤菌的寄主范围较窄 ,早先根据互接种族概念将其定名为Rhizobiumastragali,后来定名为Rhizobiumhuakuii,最近并入Mesorhizobium属。对大量菌株进行的 16S和2 3SrDNAPCR RFLP分析和代表菌株的部分 16SrDNA碱基测序 ,揭示了 7个不同基因型 ,表明这类菌具有遗传多样性 ,可以认为存在不同的种。它们都有质粒 ,数量 1～ 5个 ,因菌株而异 ,可分为不同质粒型 ,共生基因常定位在最大的一个质粒上 ,即共生质粒。它们的结瘤基因具有独特结构。采用包括nodA ,nodB ,nodC ,nodD的苜...

采用11年(2008—2018年)绿肥定位试验,研究氮钾减施20%下紫云英不同翻压量(15 000、22 500、30 000、37 500 kg/hm~2)对双季稻产量、氮素利用率及土壤氮素的影响。结果表明:与不施肥相比,施肥处理的早、晚稻产量显著增加,产量可持续指数提高,且减施氮钾20%翻压紫云英处理和单施化肥处理间的11年平均产量和产量可持续指数差异均无统计学意义;通过分析2018年的数据,与当地的常规施肥处理相比,减施氮钾20%翻压紫云英30 000 kg/hm~2能显著提高早稻生物量、氮素积累量、化肥氮素吸收利用效率(回收利用效率、农学利用效率、偏生产力)和晚稻稻草生物量、稻谷氮素积累量、总投入氮素吸收利用效率(回收利用效率、农学利用效率、生理利用率、偏生产力);适量氮钾减施翻压紫云英可提高土壤全氮和碱解氮质量分数,有效提升土壤肥力。在本研究中,氮钾减施20%时翻压紫云英30 000 kg/hm~2较适宜。

采用11年(2008—2018年)绿肥定位试验,研究氮钾减施20%下紫云英不同翻压量(15 000、22 500、30 000、37 500 kg/hm~2)对双季稻产量、氮素利用率及土壤氮素的影响。结果表明:与不施肥相比,施肥处理的早、晚稻产量显著增加,产量可持续指数提高,且减施氮钾20%翻压紫云英处理和单施化肥处理间的11年平均产量和产量可持续指数差异均无统计学意义;通过分析2018年的数据,与当地的常规施肥处理相比,减施氮钾20%翻压紫云英30 000 kg/hm~2能显著提高早稻生物量、氮素积累量、化肥氮素吸收利用效率(回收利用效率、农学利用效率、偏生产力)和晚稻稻草生物量、稻谷氮素积累量、总投入氮素吸收利用效率(回收利用效率、农学利用效率、生理利用率、偏生产力);适量氮钾减施翻压紫云英可提高土壤全氮和碱解氮质量分数,有效提升土壤肥力。在本研究中,氮钾减施20%时翻压紫云英30 000 kg/hm~2较适宜。

采用7年定位大田试验,研究紫云英与化肥配施对双季稻种植制度下水稻产量,产量构成因素,植株氮、钾吸收量及种植体系中氮、钾平衡的影响。结果表明:紫云英与化肥合理配施可提高早、晚稻产量,80%化肥与20%紫云英配施(20%GM)处理的增产效果最佳,早、晚稻两季总产较施100%化肥(100%CF)处理增产8.3%,其次为60%化肥配施40%紫云英(40%GM)处理,增产6.0%;有效穗和每穗实粒数增加是水稻增产的主要原因。紫云英与化肥合理配施可促进早、晚稻对氮素和钾素的吸收,20%GM和40%GM早、晚稻稻谷和稻

为探究紫云英（AstragalussinicusL.）在石英砂中淹水腐解对锌形态变化及有效性的影响，通过90d室内培养试验，设置不添加紫云英和4个不同紫云英添加量(1.50t·hm^-2、2.25t·hm^-2、3.00t·hm^-2和3.75t·hm^-2)5个处理，定期采集石英砂样品，测定不同形态锌和有效锌（DTPA-Zn）含量及pH值。结果表明：紫云英淹水腐解提高石英砂DTPA-Zn、交换态（Ex-Zn）、碳酸盐结合态（Carb-Zn）、氧化锰结合态（OxMn-Zn）、紧结有机态（Sbo-Zn）锌含量，降低松结有机态锌（Wbo-Zn）含量；石英砂中锌主要以Sbo-Zn和Ex-Zn存在，残渣态锌（Min-Zn）未检出；随淹水时间延长，添加紫云英促进Wbo-Zn向Sbo-Zn、Carb-Zn、OxMn-Zn转化，随紫云英添加量增多，转化为OxMn-Zn的量大于转化为Carb-Zn的量。石英砂Zn平均转化比率S2处理最低（30.9%），S4处理最高（35.9%）。到试验结束，添加紫云英降低石英砂Zn转移因子，S3处理最低（43.70%）；提高Zn分配指数，S2处理最高（37.17%）；表明石英砂中Zn 向无效态组分发生转化。研究表明：紫云英淹水腐解一个月石英砂Ex-Zn含量最高，随着时间延长，添加紫云英促进石英砂有效性较高锌形态向有效性较低锌形态转化，紫云英腐解三个月，石英砂Sbo-Zn含量最高。不同紫云英添加量，石英砂锌有效性和形态转化之间存在差异，添加2.25 t·hm^-2紫云英石英砂锌有效性最后下降最多。