[目的]本研究旨在探讨生产中普遍存在的急性应激因素对细菌耐药基因水平转移的可能影响。[方法]选取分离自断奶香猪粪便的2株喹诺酮类敏感型大肠杆菌作为试验菌株,通过测定D600值比较菌株在添加不同浓度去甲肾上腺素培养液中的生长曲线,确定去甲肾上腺素对于大肠杆菌的最佳促生长浓度;分离自断奶香猪粪便的7株携带质粒喹诺酮类耐药基因(aac(6')-lb-cr、oqx AB、qnr S)的大肠杆菌,采用滤膜接合法,计算去甲肾上腺素诱导和未诱导的大肠杆菌分离株(供体菌)与大肠杆菌J53(受体菌)的接合转移率;PCR检测

【背景】黏菌素是人医临床治疗多重耐药革兰阴性菌感染的“最后一道防线”药物，其同时作为饲料添加剂及治疗用药长期用于畜禽养殖业。2015年，我国研究人员首次报道了质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1，预示该道防线面临被攻破的风险。然而，杀菌浓度及亚抑菌浓度的黏菌素对mcr-1阳性质粒传播的影响仍未知。【目的】以流行最广的mcr-1阳性IncI2型质粒为研究对象，探究不同浓度黏菌素对该质粒接合转移频率的影响，为黏菌素的科学使用提供理论依据。【方法】使用肉汤法进行了不同浓度黏菌素（0.02 4μg·mL~(-1)）作用下携带mcr-1的IncI2型质粒的接合转移试验。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR）及构建的公式计算不同时间点（1 24 h）的接合转移频率，并分析不同浓度黏菌素对IncI2质粒接合转移频率的影响。使用PI染料、活性氧（ROS）检测试剂盒测定不同浓度黏菌素下供体菌和受体菌的细胞膜透过性和ROS产生量。选取了对照组与低中高浓度3个处理组（0.02、1、4μg·mL~(-1)）进行了转录组测序，使用Deseq2软件进行基因差异表达分析。采用Prism v8.2.0软件对不同组间接合转移频率、细胞膜透过性及ROS产生量的差异进行统计学分析。【结果】结合本研究建立的接合转移频率计算公式表明黏菌素浓度为4μg·mL~(-1)时可在不同时间点提高mcr-1阳性IncI2质粒3–10倍的接合转移频率，而其他浓度则无显著差异。转录组结果显示，与对照组相比，低中高浓度黏菌素均可显著提高IncI2质粒上IV型分泌系统相关基因的表达，其中包括virB1、virB2、virB5以及traC。此外，黏菌素增加了I型菌毛合成基因fim的转录水平。PI染色结果显示当黏菌素浓度为2和4μg·mL~(-1)时，可增强供体菌和受体菌的细胞膜透过性，且转录组结果也显示膜相关基因（ompAX、bamDE、lolB、yiaD、csgEF）的转录水平均出现显著上调。但是黏菌素作用后ROS产生量及相关基因的转录水平无显著提高。【结论】揭示了黏菌素可通过增加细菌IV型分泌系统活性、细胞膜透过性和菌毛的生成从而提高mcr-1阳性IncI2质粒在大肠杆菌间的接合转移频率。研究结果提示，杀菌浓度无法完全杀死mcr-1阳性大肠杆菌的同时，还能增加质粒传播速度。因此，畜禽养殖业中黏菌素的治疗使用可能维持mcr-1阳性质粒的存在及传播，此外鉴于黏菌素已批准用于人医临床，该现象有可能引起临床黏菌素治疗mcr-1阳性病原菌的失败。

【目的】对临床分离的宠物源大肠杆菌进行质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrD的检测,并对该基因进行序列分析和传播机制的研究。【方法】采用微量稀释法对阳性菌株进行15种抗生素的最小抑菌浓度试验;通过PCR对基因克隆,并对克隆产物和菌株阳性质粒进行转化;同时对菌株进行接合转移试验。【结果】从164株宠物源大肠杆菌中检测出1株qnrD阳性菌株(GP2009-036),GP2009-036对14种兽医临床常用抗生素耐药严重,表现为多重耐药(14耐);PCR产物经连接PMD19-T载体后可转化入DH5α感受态细胞中;接合转移试验成功地将质粒转移到大肠杆菌J53中;可从GP2009-036与其转化子中抽提出阳性...

【目的】对广州分离得到的宠物源(主要是宠物猫、狗)大肠杆菌进行质粒介导喹诺酮类耐药PMQR基因qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因的流行性检测。【方法】采用琼脂平板稀释法对164株临床分离的宠物源大肠杆菌进行15种抗菌药物的最小抑菌浓度测定。通过PCR检测qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因。建立大肠杆菌基因指纹图谱并对指纹图谱进行分析。【结果】164株宠物源大肠杆菌对12种兽医临床常用抗生素耐药率较高,且表现为多重耐药(5-14耐)。在164株宠物源大肠杆菌中检测到3个菌株同时携带qnrA、qnrB和qnrS基因,其中2株也携带aac(6′)-Ib-cr基因。阳性菌株...

为探讨畜禽源大肠杆菌临床菌株产β－内酰胺酶及其基因特性，采用常规检测法检测菌株产β－内酰胺酶情况，ＰＣＲ法检测ＥＳＢＬＳ、ＡｍＰＣ基因型，质粒结合转移试验研究耐药基因分子传播机制，并使用微量肉汤稀释法检测供体菌及接合子的药物敏感性。结果显示：４６７株食品动物源大肠杆菌未检出产碳青霉烯酶和金属β－内酰胺酶，产ＥＳＢＬＳ和ＡｍＰＣ分别达３６．８３％和１３．７０％；１７６株产β－内酰胺酶菌株检出ＢＬＡＴＥｍ、ＢＬＡＣＴＸ－ｍ、ＢＬＡＯＸＡ、ＢＬＡＣＩＴ和ＢＬＡＤＨＡ分别为８４．０９％、６０．８０％、１４．７７％、３５．８０％和１．７０％；本次质粒转移率为５０％，多数转化子获得了供体菌的耐药性及耐药基．．．

为了解河南省质粒介导的喹诺酮类耐药基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac(6′)-Ib-cr)在产16S rRNA甲基化酶鸡源大肠杆菌中的流行与分布,分别设计特异性引物对2005-2008年在河南省病鸡病料中分离保存的158株16SrRNA甲基化酶阳性鸡大肠杆菌进行PCR扩增。结果显示,在158株产16S rRNA甲基化酶鸡源大肠杆菌中,qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac(6′)-Ib-cr的检出率分别为0.6%,2.5%,13.9%,2.5%和58.2%。提示质粒介导的喹诺酮类耐药基因在河南省产16S rRNA甲基化酶鸡源大肠杆菌中普遍存在,且以qnrS和aac(6...

QseBC是一种普遍存在于细菌的双组分调控系统(two-component regulatory system,TCS),能感应细胞外环境因子信号,在调控细菌毒力中发挥着重要作用。为了研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)QseC在识别和响应宿主应激激素去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)及其对毒力因子表达的调控作用,本实验首先构建了嗜水气单胞菌NJ-35缺失突变株ΔqseC与互补株qseC+,分析了在NE诱导下野生株和突变株的体外毒力因子表达和鱼体死亡率的变化。结果表明,qseC的缺失抑制了NE对嗜水气单胞菌的促生长作用,降低了NE对生物膜形成能力和溶血活性的增强作用及其对罗非鱼的致死率,而对运动性、脂肪酶与蛋白酶活性没有产生显著影响。本实验明确了嗜水气单胞菌QseC能够响应NE,从而调节菌株的毒力,对全面认识嗜水气单胞菌的致病机理及其与宿主的互作机制有着重要意义,并为探索疾病防控新技术奠定相关理论基础。

为探明嗜水气单胞菌QseB在病原菌对鱼体应激激素去甲肾上腺素(norepinephrine， NE)的识别和响应过程中的作用，实验采用同源重组方法构建了嗜水气单胞菌NJ-35的qseB缺失突变株(ΔqseB)，比较分析了NE诱导后，野生株和突变株之间的生物膜形成能力、溶血活性和运动能力等与细菌毒力有关的生物学功能，以及对鱼体致病力的变化。结果显示，qseB的缺失显著降低了NE对嗜水气单胞菌的生长、生物膜形成、溶血活性的促进作用，减弱了嗜水气单胞菌对奥利亚罗非鱼的致死率，而对细菌运动能力和脂肪酶活性无显著影响。研究表明，NE对嗜水气单胞菌NJ-35生物膜形成和溶血活性的增强作用可能依赖于QseB，表明QseB在病原菌与宿主相互作用中发挥着重要作用。本研究进一步揭示了嗜水气单胞菌的致病机理，并为细菌与宿主相互作用的研究提供了新的理论基础。

为探讨鸡源大肠杆菌生物被膜的耐药机制,采用改进的平板培养法建立鸡大肠杆菌生物被膜体外模型,用液体二倍稀释法分别测定了鸡源大肠杆菌生物被膜菌、浮游菌和脱膜菌对克拉霉素、环丙沙星、磷霉素等13种抗菌药的敏感性,并检测了细菌生物被膜中超广谱β-内酰胺酶的产生情况。结果表明:浮游菌和脱膜菌对同种药物的敏感性几乎相同,而生物被膜菌对同种药物的耐药性比后两者显著增强,并且2株不产超广谱β-内酰胺酶的浮游菌在形成生物被膜后产生了超广谱β-内酰胺酶。由此说明,生物被膜菌的耐药性主要是由于生物被膜这种特殊结构造成的,同时,由于生物被膜的存在,促使了超广谱β-内酰胺酶的产生。生物被膜的形成和超广谱β-内酰胺酶的产...

【目的】研究鸡源大肠杆菌成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）与耐药性的关系，并对CRISPR进行生物信息学分析，为进一步研究CRISPR功能及其对细菌耐药的影响奠定基础。【方法】对从安徽省合肥地区养鸡场分离鉴定的130株鸡源大肠杆菌进行耐药性（16种抗菌药物）和CRISPR检测，分析CRISPR与鸡源大肠杆菌多重耐药的关系。挑选扩增出片段长度不同的12株大肠杆菌，对其CRISPR PCR产

为在大肠杆菌全基因组范围内筛选和鉴定与喹诺酮类抗生素耐药性相关的基因,通过对临床分离的13株大肠杆菌进行药敏试验,选择耐药谱较广泛的菌株作为研究对象,利用Mariner转座子对其基因组进行随机突变,获得转座子突变株文库,并以亲本菌株为对照筛选文库中对喹诺酮类抗生素敏感的突变体,通过套式PCR、核苷酸测序及序列比对确定突变株中转座子的插入位点及其破坏的基因。结果表明:从突变株文库中筛选得到22株分别对诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、萘啶酸敏感的突变株,其中7株对4种抗生素都敏感;插入位点分析发现,抗生素敏感

【目的】了解新疆不同动物源喹诺酮类耐药大肠杆菌携带质粒介导的喹诺酮耐药因子(plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)的流行现状,及其与主要的β-内酰胺酶基因和16S rRNA甲基化酶基因的共存情况。【方法】通过PCR方法对猪源(79株)、牛源(8株)和羊源(96株)喹诺酮类(环丙沙星,诺氟沙星和恩诺沙星)耐药大肠杆菌进行PMQR(qnrA,qnrB,qnrC,qnrD,qnrS,qepA,oqxA,oqxB,aac(6’)-Ib-cr)、β-内酰胺酶基因(blaTEM,blaCTX-M,blaSHV,blaKPC,blaCMY-2,blaLAP-1...

【目的】对广东地区分离得到的鸡源肠杆菌进行质粒介导喹诺酮类耐药(PMQR)基因检测。【方法】采用纸片扩散法对84株鸡源肠杆菌临床分离株进行27种抗菌药物的敏感性测定。通过PCR检测质PMQR基因qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr。研究PMQR基因阳性菌株染色体gyrA、gyrB、parC、parE基因喹诺酮耐药决定突变区(QRDRs)的变异情况。【结果】84株鸡源肠杆菌对兽医临床常用的恩诺沙星、氟罗沙星、氨苄西林、复方新诺明、强力霉素以及利福平、链霉素、罗红霉素的耐药率很高,且为多重耐药;对氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、多粘菌素E和头孢氨苄的敏感性高。在84株鸡源肠杆菌中检测到1株同时携...

【目的】四环素作为人类和动物临床上广泛使用的广谱抗生素,其耐药性问题一直为全球所关注。健康动物体内的共生性大肠杆菌作为耐药指示菌和耐药基因的贮存库,了解其对四环素的耐药性及耐药机制对于疾病的防控具有重要意义。【方法】从健康鸡、猪体内分离大肠杆菌,用微量肉汤法检测其对四环素的耐药性,并用PCR方法对耐药菌株中8种四环素耐药基因的携带情况进行调查,运用统计学方法分析鸡、猪体内大肠杆菌分离株的耐药性和耐药基因分布情况的差异。【结果】总共分离鉴定出大肠杆菌269株,其中86.2%的菌株对四环素产生了耐药性,健康猪体内大肠杆菌分离株的耐药性明显高于健康鸡体内分离株(P<0.05)。tet(A)、tet(...

【目的】利用重组β2肾上腺素能受体(β2AR)检测β2激动剂类药物,是弥补传统免疫学检测方法不足、实现该类违禁物多残留的快速检测手段。获得高纯度、高亲和力的重组受体是该技术的核心和难点。本文克隆猪β2 AR并构建其重组穿梭表达质粒,为筛选最适宜的受体表达系统和表达条件提供基础材料。【方法】克隆猪β2AR并进行序列分析,完成重组穿梭表达质粒构建。首先采集新鲜猪肝组织,提取总RNA,根据GenBank已登录的猪β2AR核苷酸序列(AF000134),设计1对引物并进行RT-PCR扩增。扩增产物切胶回收后与pMD-18T载体于4℃、T4连接酶作用下连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛...