【目的】探究原花青素(proanthocyanidins,PC)对体外培养的牛卵泡颗粒细胞(granulosa cells,GCs)增殖及其类固醇合成与分泌功能的影响。【方法】采集性成熟荷斯坦奶牛卵巢组织,分离卵泡GCs,使用免疫荧光对其进行鉴定。用不同质量浓度(10,30,50,70和90μg/m L)的PC对牛卵泡GCs作用不同时间(12,24和48 h)后,测定GCs存活率。以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测10,50和90μg/m L PC对牛卵泡GCs周期相关基因(CCND1和CCND2)、凋亡相关基因(caspase-3、caspase-9和Bim)以及类固醇激素合成相关基因(CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD)相对表达量的影响,并检测培养上清液中类固醇激素(雌二醇(E2)和孕酮(P4))的浓度。【结果】分离获得了纯度较高的牛卵泡GCs。当PC质量浓度为50μg/m L且培养24 h时,牛卵泡GCs的存活率最高。当PC质量浓度为50μg/m L时,牛卵泡GCs周期相关基因CCND1和CCND2相对表达量均极显著升高(P<0.01);凋亡相关基因caspase-3和caspase-9相对表达量均极显著降低(P<0.01),Bim相对表达量显著降低(P<0.05);E2和P4浓度均极显著增加(P<0.01);类固醇激素合成相关基因CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD相对表达量均极显著升高(P<0.01)。当PC质量浓度为10μg/m L时,牛卵泡GCs凋亡相关基因caspase-3的相对表达量显著降低(P<0.05);P4浓度显著增加(P<0.05);CYP19A1和3β-HSD相对表达量均显著升高(P<0.05),CYP11A1和STAR相对表达量均极显著升高(P<0.01)。当PC质量浓度为90μg/m L时,E2浓度显著增加(P<0.05),P4浓度极显著增加P<0.01);CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD相对表达量均极显著升高(P<0.01)。【结论】50μg/m L PC通过促进牛卵泡GCs周期相关基因的表达和抑制凋亡相关基因的表达而促进牛卵泡GCs的增殖。10～90μg/m L PC通过促进类固醇激素合成相关基因的表达而促进了牛卵泡GCs合成和分泌类固醇激素,进而影响牛卵泡GCs类固醇激素合成与分泌功能。

[目的]本试验旨在探究甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成功能以及增殖的影响。[方法]首先采用免疫组化法鉴定甲状腺素受体(TRα/β)在猪卵巢组织的表达情况,随后体外培养猪卵巢原代颗粒细胞,选取低(10-8mol·L(-1))、中(10-7mol·L(-1))、高(10-6mol·L(-1))3种浓度的甲状腺素(T4)孵育24 h,采用酶联免疫法检测细胞培养液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)水平,并采用蛋白印迹法检测颗粒细胞内激素合成相关酶蛋白(3β-HSD、CYP19)的表达情况。采用MTT法检测各

【目的】研究猪有腔卵泡发育和闭锁中颗粒细胞凋亡与卵泡液类固醇激素的变化,为了解猪有腔卵泡发育与闭锁的调控机理提供参考。【方法】从猪卵巢分离完整有腔卵泡,按质量分为健康卵泡、早期闭锁卵泡和晚期闭锁卵泡3类;再按卵泡直径大小分为大卵泡组(>5 mm)、中卵泡组(3~5 mm)和小卵泡组(

【目的】卵泡发育是一个复杂的调控过程，其中绵羊卵泡颗粒细胞（granulosa cells, GCs）的增殖，分化会直接影响卵泡的发育状况。TGF-β信号通路在绵羊卵巢发育和卵泡生长过程中起着重要作用，Smad7作为TGF-β信号通路关键性的抑制基因也发挥重要作用，通过探究Smad7介导TGF-β信号通路对绵羊卵泡GCs增殖凋亡的影响，为进一步研究Smad7在卵泡GCs增殖凋亡过程中的调控作用提供依据。【方法】选取4—6月龄未怀孕的晋中健康杜湖杂交母羊20只，屠宰后采集双侧卵巢组织，分离培养卵泡颗粒细胞，FSHR细胞免疫荧光鉴定，Smad7细胞免疫荧光的表达定位，CCK8法测定细胞增殖情况，绘制生长曲线；细胞传代后外源添加不同浓度Smad7激动剂积雪草苷（asiaticoside,AS）(0、100、200、400、600 ng·mL-1)培养绵羊卵泡GCs，选择AS最佳作用浓度处理二代颗粒细胞，采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测TGF-β信号通路中关键基因及细胞凋亡和周期相关基因表达水平；合成3个siSmad7，转染至卵泡GCs中，选择干扰效果最佳的，采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测TGF-β信号通路中关键基因及细胞凋亡和周期相关基因表达水平。【结果】Smad7在绵羊卵泡GCs中有表达；200 ng·mL-1 AS能极显著上调Smad7在GCs的表达（P <0.01）,siSmad7-1对绵羊卵泡GCs的转染效果最佳（P<0.01）;Smad7上调能显著增加TGF-β信号通路Smad4,TFDP-1和EP300的表达量（P<0.05），极显著增加TGF-β信号通路SP1的表达（P<0.01），显著增加凋亡相关基因Caspase8的表达量（P<0.05），极显著增加凋亡相关基因Caspase3和Bim的表达量（P<0.01），显著升高细胞周期相关基因P21和P27的表达量（P<0.05），极显著升高细胞周期相关基因CCND2的表达量（P<0.01），而CCND1的表达量显著降低（P<0.05），极显著降低TGF-β信号通路SP1的表达量（P<0.01），显著降低凋亡相关基因Caspase8的表达量（P<0.05），极显著降低凋亡相关基因Caspase3和Bim的表达量（P<0.01），极显著降低细胞周期相关基因P21,P27和CCND2的表达量（P<0.01），极显著升高CCND1的表达量（P<0.01）。【结论】Smad7介导TGF-β信号通路抑制绵羊卵泡GCs增殖和促进细胞凋亡。

［目的］本试验旨在研究毛喉素（FSK）对体外培养的猪卵泡颗粒细胞分化的作用及其机制。［方法］体外分离培养猪原代卵泡颗粒细胞，预培养24 h。应用FSK（10 nmol·L~(-1)）处理细胞48 h，检测细胞形态、脂滴积聚、标记基因和周期相关基因表达；处理96 h检测孕酮（P_(4)）水平及类固醇合成相关蛋白的表达。［结果］与对照组相比，FSK改变了细胞形态，增大了细胞直径，并使细胞内脂滴含量增加（P < 0.01）；FSK降低了细胞的增殖活性和增殖细胞核抗原（PCNA）mRNA的表达水平（P < 0.01）；FSK降低了颗粒细胞标记基因促卵泡素受体（FSHR）mRNA的表达水平，提高了黄体细胞标记基因前列腺素受体（PTGFR）和促黄体素受体（LHCGR）mRNA的表达水平（P < 0.01）；FSK促进了P_(4)分泌，提高了类固醇合成相关蛋白StAR、P450scc和3β-HSD的表达水平（P < 0.01）；从细胞周期看，FSK降低了细胞周期素B1（CCNB1）、细胞周期素D1（CCND1）和细胞周期蛋白依赖性激酶1 (CDK1）、细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）基因的表达（P < 0.01），而使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A/B（P21~(cip1)/P27~(kip1)）基因表达上调（P < 0.01），并将细胞周期阻滞在G0/G1期。［结论］FSK能够通过抑制细胞增殖、增强脂滴积聚和孕酮合成代谢、退出细胞周期来促进颗粒细胞向黄体细胞转化。

【背景】颗粒细胞类固醇激素的合成能力对卵泡发育及成熟具有重要作用，但其关键的调控因子尚不完全清楚。笔者前期的研究表明肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)基因参与细胞的脂类代谢，类固醇激素的合成与脂类代谢密切相关，并且有研究结果亦显示LKB1敲除可引起小鼠卵巢早衰，表明LKB1对维持卵巢的功能很关键，其在颗粒细胞的确切功能需要进一步研究。【目的】探究LKB1在牛卵泡中的表达模式及其对颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用,为母牛繁殖生理调控研究提供理论依据。【方法】采用免疫组织化学染色对LKB1蛋白在卵泡中进行定位研究；同时分离培养牛原代颗粒细胞，并以促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor, FSHR）蛋白作为标记基因，细胞免疫荧光染色鉴定颗粒细胞及纯度；然后以原代颗粒细胞为模型，采用siRNA沉默LKB1的技术，利用qRT-PCR方法检测LKB1功能缺失对类固醇激素合成相关基因表达的影响，另一方面采用腺病毒过表达LKB1,qRT-PCR和ELISA技术验证LKB1对类固醇激素合成相关基因表达的调控作用及雌二醇分泌。【结果】1) LKB1蛋白在卵泡中的细胞均表达，但颗粒细胞的染色信号强于膜细胞，进一步的定量分析显示颗粒细胞的表达量显著高于卵泡膜细胞。2)分离培养的牛原代卵泡颗粒细胞贴壁生长、细胞形态多呈圆形，能被颗粒细胞标志基因FSHR抗体标记。3) RNAi技术能显著抑制LKB1的表达。与对照相比，siRNA1和siRNA2干扰LKB1的效率分别为48%(P<0.05)和52%(P<0.01)、CYP11A1(P<0.05)的表达，进一步研究显示LKB1基因功能获得促进颗粒细胞雌二醇的分泌（P<0.05）。【结论】LKB1在卵泡颗粒细胞中高表达，促进类固醇激素生成基因STAR、CYP11A1和CYP19A1的表达和雌二醇的分泌。本研究将为LKB1调控牛颗粒细胞类固醇激素合成的功能提供直接的理论依据。

为了探讨小鼠卵巢颗粒细胞体外生长的特点及增殖的调控因素,分别添加2μg/mL胰岛素、50ng/mL FSH和20 ng/mL EGF的培养液培养小鼠卵巢颗粒细胞,每隔24 h对细胞进行计数,研究其对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响。此外,还对培养过程中出现的卵巢颗粒细胞集落进行了AKP染色和C-kit免疫组化染色鉴定。结果显示,在培养的第4天添加EGF组和FSH组与对照组相比均具有显著的促增殖作用(P0.05);卵巢颗粒细胞集落经AKP染色和C-kit免疫组化染色均呈阳性。提示EGF和FSH对小鼠卵巢颗粒细胞具有促增殖效应,小鼠卵巢颗粒细胞具有干细胞的...

【目的】研究FSH处理对猪卵巢颗粒细胞类固醇合成酶、垂体激素受体、凋亡相关等基因表达的影响及此过程中组蛋白H3修饰的变化情况。【方法】首先,采集猪卵巢组织并用注射器抽取方法收集卵泡颗粒细胞,用含血清体系体外培养颗粒细胞至贴壁,血清饥饿16h后用终浓度5IU·mL~(-1)的FSH处理24h,并收集细胞。其次,提取细胞m RNA,采用qRT-PCR方法检测类固醇合成酶(STAR、CYP11A1、HSD3B和CYP19A1)、垂体激素受体(FSHR和LHR)、凋亡相关基因(XIAP和Fas L)m RNA的表达变化,最后,相同处理后固定细胞,采用染色质免疫沉淀结合q PCR(Ch IP-q PCR)方法检测类固醇合成酶基因STAR、CYP19A1和HSD3B上游转录调控区组蛋白H3修饰(H3K4me2、H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac)状况。【结果】5IU·mL~(-1)的FSH处理引起类固醇合成酶基因STAR、CYP19A1和HSD3B分别为2倍(P<0.01)、2.8倍(P<0.01)和3.6倍(P<0.01)、13.6倍(P<0.01)、19.7(P<0.01)倍和2.5倍(P<0.05)的显著上调;STAR基因调控区的H3K9ac在处理后有11.1倍的显著下降(P<0.05);CYP19A基因调控区的H3K4me3和H3K9ac分别有0.5倍的上调(P<0.01)和10.4倍(P<0.01)的下降,其余组蛋白修饰在处理前后没有显著变化。【结论】FSH处理24h对颗粒细胞类固醇合成酶基因转录有显著上调作用,对其转录过程有H3组蛋白修饰参与,组蛋白修饰模式具有基因特异性。垂体激素受体和凋亡相关基因的应答可能需要FSH和其他因素的联合作用。

选用正在产蛋的罗曼鸡 ,取其排序第 3的卵泡分离颗粒层细胞 ,用含血清培养基培养 ,并用含脂质体每孔 0 0 ,0 6,1 2 ,2 4,4 8μL和 bcl 2基因重组质粒每孔 0 2 μg转染卵泡颗粒细胞。用流式细胞术等方法分析转基因后的原代细胞和传代细胞的生长与凋亡情况。结果发现 ,与未转染组相比 ,转染后的传代细胞分裂速度较快 (P

【目的】研究kisspeptin-10对无血清培养的鸡卵泡颗粒细胞孕酮分泌的作用及可能机制。【方法】选取200日龄处于产蛋高峰期的伊莎蛋鸡,于排卵前剖腹收集F1卵泡,分离纯化颗粒细胞,于含胎牛血清培养基中培养24 h,换成无血清培养基稳定培养24 h后,用不同浓度的Kp-10、U73122、EGTA等单独或共同处理细胞,收集细胞上清,放射免疫学方法检测培养基中孕酮含量。【结果】(1)通过免疫细胞化学方法,显示颗粒细胞上有Kp-10免疫活性样物质的阳性表达;(2)Kp-10处理可显著增加无血清培养的颗粒细胞的活力,100 nmol.L-1时可显著促进孕酮的分泌(P<0.05);(3)与对照组相比...

选用正在产蛋的罗曼鸡,取体积排序第一(F1)和第四(F4)的卵泡,分离颗粒细胞层细胞。采用脂质体介导方法将来源于F1和F4卵泡的颗粒细胞用PBS(对照)、空载体或Bcl2重组质粒处理,然后在不完全无血清培养基(不添加胰岛素)中培养48和96h,用流式细胞术检测Bcl2蛋白表达,用放射免疫测定技术检测IGF1的含量。结果发现,转染Bcl2重组质粒组的Bcl2蛋白表达量和IGF1分泌量均多于其他各组。分析来源于不同卵泡期卵泡颗粒细胞的分泌功能,发现随时间的增加F1细胞IGF1分泌量减少,而F4的IGF1分泌量基本不变。结果表明,在鸡卵泡颗粒细胞中转染的Bcl2基因具有表达功能,表达的蛋白具有调节鸡...

[目的]本试验旨在研究卵泡抑素（Follistatin， FST）基因对湖羊卵巢颗粒细胞（Granulosa Cells， GCs）增殖及凋亡的影响，为揭示FST基因对湖羊繁殖调控机理的影响提供理论基础。[方法]首先利用免疫组织化学方法检测FST在卵巢组织中的表达特征；然后利用EdU、qRT-PCR、WB、流式细胞等技术，分析FST基因过表达和干扰对湖羊卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响；最后通过RNA-seq分析FST基因干扰前后湖羊卵巢颗粒细胞的转录组表达差异变化。[结果]FST在湖羊卵巢颗粒细胞内高表达，干扰FST能抑制湖羊卵巢颗粒细胞增殖，降低细胞中PCNA基因的mRNA和蛋白水平，过表达FST则表现出相反的趋势；RNA-seq结果进一步显示干扰FST后颗粒细胞中细胞周期调控、卵母细胞减数分裂、孕激素分泌等相关功能及通路发生显著变化。[结论]FST可以促进湖羊GCs增殖，抑制GCs凋亡，影响卵母细胞分裂、生殖激素分泌相关基因的表达，进而参与湖羊卵泡发育进程。

采用细胞体外培养的方法,在卵巢颗粒细胞对数生长期,对F-2毒素的繁殖遗传毒性和V-E对其的解毒作用进行了研究.结果表明,各毒素组细胞活性显著低于正常对照组,而丙二醛(MDA)含量显著低于正常对照组;各解毒组细胞活性均显著高于各毒素组,但明显低于正常对照组,而MDA含量显著低于各毒素组,但明显高于正常对照组.这表明,F-2毒素可能是通过脂质过氧化作用,对颗粒细胞致毒,V-E对F-2毒素具有较好的解毒作用,能提高中毒卵巢颗粒细胞的抗过氧化能力.

为研究大鼠卵巢颗粒细胞(GC)的分泌功能,用氯丙嗪染毒体外培养的大鼠GC,采用MTT法检测细胞相对活力,ELISA法检测收集培养液中孕酮(P)和雌二醇(E2)的含量,半定量RT-PCR检测激素分泌相关调控基因FSHR、StAR、P450scc和P450arom mRNA的表达,免疫细胞化学染色法检测细胞中特异卵泡刺激素受体的表达。结果表明:经0.1、1.0和10.0μmol/L氯丙嗪染毒24 h后,与对照组相比,细胞相对活力分别为87.95%、83.96%和74.48%,E2的分泌量和StAR mRNA相对表达水平分别从对照组的6.16 pg/μg、2.014显著下降到3.70 pg/μg、0...

表皮生长因子 (EGF)是参与卵巢功能调节的一个重要肽类因子。关于 EGF对小鼠胚胎期卵巢卵泡发育和类固醇激素发生的作用至今未见报道。本研究以单个卵巢的总卵泡数、生长卵泡数和 5个最大卵母细胞的平均直径为卵泡发育优劣的衡量指标 ,利用我们早期研究建立的无血清培养体系研究了 EGF对胎鼠卵巢卵泡发育和类固醇激素分泌的作用。结果发现 :1EGF处理组胎鼠卵巢总卵泡数、生长卵泡数和卵巢内 5个最大卵母细胞平均直径从培养第 7天起即显著高于 ITS对照组直至培养结束 ;2 EGF在培养后期显著促进胎鼠卵巢分泌睾酮 ,但对雌二醇的基础分泌无影响 ;3EGF处理组胎鼠卵巢在培养过程的后期引起贴壁的卵巢边缘...