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[期刊] 中国农业科学
[作者]
吴晓平 吴异健 韩典霖 吴宝成 黄一帆
【目的】探讨原核表达的番鸭呼肠孤病毒(DRV)外壳蛋白σC与σB对于雏番鸭的免疫保护作用,为研制有效的DRV亚单位疫苗提供理论基础。【方法】对pET-30a-S3/BL21重组菌与pET-30a-S4 ORF2/BL21重组菌进行稳定性检验,表达的重组蛋白进行纯化和复性后,进行油乳剂制备,50只1日龄雏番鸭随机平均分为5组,即DRVσB蛋白免疫组、DRVσC蛋白免疫组、DRVσB+σC蛋白免疫组及PBS对照组和攻毒对照组,免疫组皮下接种剂量为500μg/只,7日龄时进行二次免疫,14日龄时进行攻毒试验,ELISA和琼扩(AGP)检测抗体水平并计算保护指数。【结果】重组菌具有良好的稳定性,各免疫...
关键词：
番鸭呼肠孤病毒 σC与σB蛋白 免疫保护
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
王全溪 赵丽娟 苏凤 吴宝成 李国平
番鸭感染番鸭呼肠孤病毒后,在感染早期(15 d内),外周血淋巴细胞转化率比对照显著下降(P<0.01),外周血T淋巴细胞ANAE阳性率比对照显著下降(P<0.01),IL-2含量也比对照组显著下降(P
关键词：
番鸭呼肠孤病毒 细胞免疫 番鸭 感染
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王全溪 吴宝成 李国平 黄一帆
【目的】探讨番鸭呼肠孤病毒感染对体液免疫功能的影响。【方法】将60只5日龄健康番鸭,随机平均分为两组,分室隔离饲养。试验组雏鸭每只腿部肌肉注射番鸭呼肠孤病毒细胞毒0.2mL(0.01个TCID50=10-3.7558),对照组相同部位注射等量灭菌生理盐水,每隔5d,应用组织化学法检测脾脏和法式囊中浆细胞数量,间接血凝法检测血清中禽流感抗体水平和放射免疫法检测血清中IL-2,IL-6含量的变化。【结果】番鸭感染呼肠孤病毒,法氏囊和脾脏中浆细胞数量试验组均比对照组少,在感染后15d达到最少,试验组极显著地低于对照组(P<0.01);同时,番鸭感染呼肠孤病毒可抑制禽流感抗体形成,感染后15d抗体水平...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
屈贵蜀 何晴 严梦涵 陆芍华 黄瑞玲 彭瑶顺 庄许诺 许丽惠 王全溪
为制备番鸭呼肠孤病毒(MDRV)p10.8蛋白的单克隆抗体(mAb),利用原核表达系统表达p10.8蛋白,采用Ni-NTA亲和层析法对其进行纯化,选择BALB/c小鼠进行免疫.4免后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,并以纯化的重组p10.8蛋白作为抗原包被,用间接ELISA法筛选到1株针对MDRV p10.8蛋白的能稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株,命名为H3-7B株.用Western blotting法进行检测,以H3-7B株上清为一抗,分别与原核、真核表达系统获得的重组p10.8蛋白反应,结果均呈阳性.用抗体亚类试剂盒进行抗体亚类测定,显示H3-7B株mAb亚型为IgG2a类.用MDRV、禽腺病毒、鸭坦步苏病毒3种病毒与H3-7B株mAb进行Western blotting鉴定反应,特异性反应结果表明,H3-7B株mAb与MDRV反应呈阳性,特异性较好.结论:本试验成功制备了抗MDRV p10.8蛋白的mAb.
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王杭军 叶星 田园园 张莉莉 瞿兰 张蕊
根据草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108编码VP5的M5基因的cDNA序列,分别设计合成带特定酶切位点的特异引物,进行PCR扩增;通过酶切与连接,构建2种重组表达载体pET30c-M5和pColdⅡ-M5,分别转化于大肠杆菌并进行诱导表达;对培养基、诱导时间、诱导剂浓度和温度等条件进行优化,确定最适表达体系。通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。结果显示,所构建的2种VP5蛋白原核表达载体,均在大肠杆菌中成功表达了分子质量大小(约80ku)与预期相符的重组蛋白,表达产物主要存在于包涵体中。诱导表达后的菌体经离心、洗涤与超声破碎,离心收集包涵体。包涵体通过变性、透...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
盛佳璐 宗乾坤 喻飞 王浩 吕利群
草鱼Ⅱ型呼肠孤病毒是当前引起我国草鱼出血病的主要流行毒株,VP56是其外层衣壳上的唯一突起蛋白并有可能在病毒入侵阶段发挥核心作用,但该蛋白的具体功能尚不清楚。为了探讨VP56的生物学功能,分别利用大肠杆菌原核表达系统和杆状病毒真核表达系统研究了VP56的体外表达特性。首先从GCRVJX02W株的细胞感染混合物中抽提总RNA,并通过RT-PCR方法获得目的基因VP56,分别克隆至pGEX-4T-3及pFastBacHTA载体上,将质粒pGEX-4T-3-VP56转化至BL21(DE3),经IPTG诱导后,成功表达融合蛋白GST-VP56,大小为83ku,以包涵体形式存在;蛋白经纯化后免疫老鼠,制备了VP56的多克隆抗体,可以和rVP56产生特异性免疫结合。将pFastBacHTA-VP56转化至DH10Bac,成功转座后,提取重组杆粒DNA并鉴定且测序正确后转染SF9昆虫细胞。结果表明,自转染96h起,转染杆粒的细胞生长停滞,不断裂解。Westernblot结果显示,细胞表达重组蛋白His-VP56,大小约为62ku,为可溶蛋白。本研究利用原核表达系统和真核表达系统体外表达了VP56蛋白,制备了抗VP56多克隆抗体,为深入研究VP56蛋白在病毒入侵时的生物学功能奠定了基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李爽 谷长勤 白家媛 张红 张万坡 程国富 胡薛英
【目的】观察鸭源呼肠孤病毒对雏鸭脾、法氏囊的病理损伤及相关免疫指标,初步阐明鸭源呼肠孤病毒对所引起的机体免疫器官损伤以及机体免疫抑制,为进一步探讨发病机理和免疫防治提供理论依据。【方法】7日龄樱桃谷雏鸭人工感染鸭源呼肠孤病毒,分别观察脾、法氏囊组织病理学变化,检测脾、法氏囊指数,外周血CD3+、CD8+T细胞阳性率,脾、法氏囊IgY生成细胞,并分析试验组及对照组差异显著性。【结果】感染鸭源呼肠孤病毒后,雏鸭脾出现明显坏死灶,之后出现肉芽肿结构,法氏囊固有层淋巴滤泡明显减少;脾、法氏囊指数降低;外周血CD3+、CD8+T细胞阳性率降低;脾IgY生成细胞数量增多、法氏囊IgY生成细胞数量减少。【结...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
许泽锴 郑钰 张凯照 胡会 沈沛津 吴异健 黄小红
探讨连翘苷对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)增殖及对炎症相关细胞促炎因子和趋化因子基因表达水平的影响.采用噻唑蓝(MTT)法检测连翘苷对鸡胚成纤维细胞DF-1的安全质量浓度为0～125.00μg·mL~(-1),并筛选出最佳的给药方式为：先感染病毒再给药连翘苷.采用半数组织培养感染剂量(TCID_(50))检测MDRV在DF-1细胞中的增殖情况，结果表明，给药24～48 h时，连翘苷能使MDRV滴度极显著下降(P<0.05).综上，连翘苷能抑制MDRV在DF-1细胞中的增殖，并降低细胞炎症因子基因的表达水平，具有良好的抗病毒和抗炎的双活性.
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
武鸿 康亚男 唐荣宏 陈冰 郁宏伟 鲍恩东
[目的]本文旨在对临床表现为肝、脾坏死的病死鸭进行鸭呼肠孤病毒(NDRV)分离与鉴定。[方法]通过接种10日龄鸭胚进行病毒的初步分离培养,结合PCR检测及σC基因序列分析进行分子生物学鉴定。将NDRV分离毒株接种鸡肝癌细胞(LMH)、鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肝细胞(CEL),经绒毛尿囊膜接种11日龄樱桃谷肉鸭胚,经腿部肌肉接种4日龄雏樱桃谷肉鸭进行生物学特性鉴定。通过测定NDRV分离毒株对氯仿和胰蛋白酶的敏感性进行理化特性鉴定。[结果]分离到5株新型鸭呼肠孤病毒(NDRV),分别为RPVA1311、RPVA1312、RPVA1313、RPVA1314和RPVA1315。NDRV分离毒株σC基因序列与新型鸭呼肠孤病毒的核苷酸同源性为94%～98%,与禽呼肠孤病毒(ARV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)相似性较低,分别为38%～41%和40%～50%; NDRV分离毒株能在LMH、CEF和CEL中增殖并产生细胞融合,形成合胞体的细胞病变,2株番鸭源分离病毒的LMH细胞毒滴度(lg[TCID_(50)]:6.32、6.63)明显高于3株樱桃谷肉鸭源病毒的滴度(lg[TCID_(50)]:5.83、5.68、5.63); NDRV分离毒株能100%致死11日龄樱桃谷肉鸭胚,且2株番鸭源分离病毒的鸭胚组织毒滴度(lg[ELD_(50)]:5.50、5.63)稍高于3株樱桃谷肉鸭源病毒的滴度(lg[ELD_(50)]:5.32、5.17、5.00),主要病变表现为全身性出血; 4日龄雏樱桃谷肉鸭接种NDRV分离毒株后,出现与自然发病鸭相似的病症,发病率为100%,同时能从病死鸭的肝、脾中再次分离到原病毒;病死鸭主要病变为脾脏肿大、坏死,组织病理学观察可见脾脏淋巴细胞数量减少、组织细胞坏死,肝细胞变性、炎性细胞在汇管区周围浸润;理化性质测定结果显示,NDRV分离毒株对氯仿不敏感,对胰蛋白酶具有不同程度的敏感性。[结论]分离的5株病毒是属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属的一种新型鸭呼肠孤病毒。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
周勇 范玉顶 徐进 李艳秋 肖艺 曾令兵
以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pC...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
苏岚 曾令兵 周勇 张辉 高正勇 张金凤
根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,...
[期刊] 水产学报
[作者]
郝贵杰 潘晓艺 姚嘉赟 徐洋 尹文林 沈锦玉
将编码草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)主要衣壳蛋白VP70.9kb的基因片段连接至克隆载体pMD19-T中,筛选阳性克隆并测序,经检测为正确序列后,再将目的片段克隆入真核表达载体pCI,筛选得到阳性重组质粒pCI-VP7。然后构建pCI-VP-GFP重组表达质粒(即GFP基因与VP7的一段上游基因融合表达),用PCR及酶切方法鉴定克隆的正确性。并用脂质体法将其转染入真核细胞COS-1和CIK进行瞬时表达,荧光显微镜观察及RT-PCR特异性检测。结果表明,GFP基因与VP7的一段上游基因被成功转染到COS-1和CIK细胞,并得到了很好的表达。进而证明pCI-VP...
关键词：
草鱼呼肠孤病毒 衣壳蛋白 转染 真核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张强 崔百明 郑银英 向本春
【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋...
关键词：
南方番茄病毒 外壳蛋白基因 原核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙莹 李俊平 黄小洁 李岭 曹明慧 李启红 李慧姣 杨承槐
【目的】鸭肠炎病毒（ｄｕｃｋ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ｄｅｖ）不同毒株间存在明显差异，ｄｅｖ疫苗株的ｕＬ２基因在１９５ｂｐ后连续缺失５２８ｂｐ，导致第６５位氨基酸后连续缺失１７６ａａ～（［１］）。将绿色荧光蛋白（ＧＦｐ）基因插入ｄｅｖ ｕＬ２基因中，获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒，以研究ｕＬ２基因对ｄｅｖ生物特性的影响和探讨ｄｅｖ作为载体表达外源基因的可行性。【方法】以实验室保存的ｄｅｖ细胞适应株ｄｎａ为模板，利用ｐｃｒ技术扩增出病毒ｕＬ２基因上下游序列并克隆入ｐＭｄ－１８ｔ载体；以ｕＬ２基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂，将ｃＭｖ启动子控制的含有ＧＦｐ－Ｇｐｔ基因表达盒克隆入ｄｅｖ．．．
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
吴异健 王劭 黄一帆 吴宝成
参考GenBank上公布的禽呼肠孤病毒(ARV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)σ非结构基因(σNS)序列设计合成一对引物,对番鸭源呼肠孤病毒YJL株σNS全基因进行RT-PCR扩增,克隆到pMD18-T载体中,并对克隆产物进行PCR鉴定和测序;YJL株σNS的编码基因位于S4节段,基因全长1192 bp,其5′端和3′端序列分别为5′-GCTTTT和3′-TATTCATC,具有典型的禽正呼肠孤病毒基因末端碱基序列;σNS基因只有一个有效阅读框(24-1127 bp),编码由367个氨基酸组成的σNS蛋白;σNS蛋白的分子质量约为40.57 ku,等电点(PI)为7.875.YJL株与法国MDRV...
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