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[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
曲玥阳 陈旭 岳喜庆 罗勇 赵伟杰 林炳承
为建立理想的研究农药中毒性肾病体外细胞模型,系统考察了原代肾小管上皮细胞提取和培养的一系列关键因素,经过优化组合,提出了一种更为高效实用的原代肾小管上皮细胞提取和培养方法。通过显微镜明场观察肾小管节段组织形态和纯度,研究0.1%的Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶在15min和3h的时候对组织的消化情况以及Ⅱ型胶原酶作用0min,8min,15min,40min,1h,3h时组织消化情况。利用MTT比色法考察了鼠尾I型胶原,层粘连蛋白,基质胶对培养皿的包被情况对细胞增殖速率的影响,利用MTT比
关键词：
肾小管上皮细胞 原代培养 长期培养
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
向华 张彦明 程媛媛 康恺 杨幼聪
【目的】建立新生山羊肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cell,RTECs)的分离培养方法。【方法】采集刚出生未哺乳健康山羊的肾脏,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ消化法分离培养RTECs,选择孔径0.15mm的筛网对RTECs进行纯化,观察各组RTECs的生长情况;对分离的RTECs进行免疫组化和碱性磷酸酶染色鉴定,并进行透射电镜观察;用流式细胞仪检测RTECs的增殖周期和凋亡情况。【结果】胶原酶Ⅳ对RTECs的消化效果优于胶原酶Ⅰ,所得的细胞团块多,纯度高,细胞生长快,经孔径0.15mm的筛网过滤后,RTECs的纯度达95%以上,并可连续传至第12代。分离获得的细...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
宋增福 吴天星 潘晓东
探讨了健康鲫(Carassius auratus)幼鱼肠道上皮细胞的原代培养方法。结果显示,用含有抗生素、胶原蛋白酶Ⅰ、EDTA和胶原蛋白酶Ⅳ组成的D-Hanks液消化无菌分离的鲫肠道可以获得大量细胞团及绒毛隐窝;用含有抗生素、胎牛血清(FBS)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素的DMEM培养液进行培养,并根据肠道上皮细胞与成纤维细胞贴壁时间的差异进一步纯化,连续培养12d后可以得到纯化的肠道上皮细胞。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
赵倩明 左晓昕 詹康 隋雁南 封飞飞 赵国琦
为研究小肽转运蛋白对小肽转运和吸收机制提供细胞模型,在体外建立原代奶牛小肠上皮细胞分离的方法,采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶混合消化液对奶牛小肠组织进行消化,通过2%山梨醇进行密度梯度离心以去除单核细胞、淋巴细胞和肌细胞;用刮除法、相差消化法和96孔板单克隆方法来纯化奶牛小肠上皮细胞,从细胞形态学、细胞角蛋白18免疫荧光染色和小肠上皮细胞特异性标志蛋白来鉴定奶牛肠上皮细胞。结果表明:1)采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶联合消化奶牛小肠组织,通过2%山梨醇密度梯度离心可以获得大量的细胞团且48h发生贴壁,但是细胞贴壁
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
冯子建 孙娜 郝志立 孙盼盼 张华 范阔海 尹伟 杨惠珍 钟佳 张振彪 王建中 孙耀贵 李宏全
为建立一种快速分离犬原代乳腺上皮细胞的培养方案，本研究旨在从健康泌乳金毛犬的乳汁中分离原代乳腺上皮细胞，接种于两种不同的培养基后传代培养，探讨不同培养基下细胞的生物学特征，提供犬乳腺上皮细胞简单便捷的分离措施及适宜的培养方法。选取泌乳一周的金毛犬在无菌条件下收集乳汁，离心处理后得到乳腺上皮细胞，分别用完全培养基和基础培养基接种培养，经形态学对比观察，间接免疫荧光检测角蛋白8(Cytokeratin 8)表达情况，绘制两种培养基培养下的第3代乳腺上皮细胞生长曲线；探讨完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞的冻存复苏活力。结果表明：1)乳汁分离可得到大量细胞团块，分别接种两种培养基后都会出现“煎蛋样”贴壁细胞，消化传代后两者均有Cytokeratin 8的高度表达；2)接种于基础培养基的细胞前期以聚集在一起的圆形单克隆细胞团块为主，传至第4代仅有少量细胞存活，细胞随着培养时间增加而状态变差，死亡细胞增多；接种于完全培养基的细胞整体呈“鹅卵石铺路样”成片生长，随着传代次数增加细胞状态稳定，细胞生长曲线呈现“S”形；3)完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞冻存复苏后能快速贴壁并分裂增殖。综上，乳汁分离法成功分离犬乳腺上皮细胞，且与基础培养基相比，完全培养基可以更好地维持细胞活性，促进细胞增殖分裂，且不影响细胞冻存后复苏的活力，为后期快速分离犬乳腺上皮细胞提供较优的培养方案。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
赵杰 周天红 刘选辉 冯士彬 辜丽川 李玉 吴金节 王希春
[目的]本试验以犬肾小管上皮细胞(Madin-Daby canine kidney cell, MDCK)为模型，研究赭曲霉毒素A(OTA)对MDCK的毒性作用以及番茄红素(lycopene, LYC)对细胞损伤的缓解效应。[方法]将对数生长期MDCK,随机分为对照组(无添加)、OTA组(15μmol·L~(-1) OTA)、LYC组(55μmol·L~(-1) LYC)、O+L组(15μmol·L~(-1) OTA+55μmol·L~(-1) LYC),处理36 h,研究OTA对MDCK细胞结构、细胞凋亡、肾功能相关指标、氧化与抗氧化、炎性因子等指标的影响，并探讨LYC在OTA致MDCK损伤中的缓解作用。[结果]OTA作用导致细胞发生明显皱缩，细胞数量骤减；电镜结果显示OTA能够导致细胞膜破裂、细胞器出现不同程度损伤，MDCK中乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧(ROS)水平与丙二醛(MDA)含量极显著增加(P<0.01),超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性极显著降低(P<0.01);细胞中肾功能相关指标N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、β2-微球蛋白(β2-MG)、肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、肾损伤分子1(KIM-1)、视黄醇结合蛋白(RBP)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)均极显著升高(P<0.01);同时极显著增加了MDCK的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素6(IL-6)、干扰素18(IL-18)及干扰素1β(IL-1β)的水平(P<0.01);OTA可诱导MDCK凋亡率极显著升高(P<0.01);而LYC能够有效减缓OTA造成的损伤，LYC组与OTA处理组相比形态较饱满，细胞间衔接紧密，细胞凋亡率显著下降；LDH、ROS、MDA水平(含量)降低，SOD、CAT、GSH-Px活性升高，并降低炎性细胞因子的表达。[结论]OTA能够抑制MDCK活性，改变细胞形态，导致肾功能指标、氧化与抗氧化功能与细胞炎性因子异常，加快细胞凋亡；LYC能够显著缓解OTA对MDCK的损伤。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
姚仕彬 叶元土 蔡春芳 姚林杰 许凡 刘猛 萧培珍 王丽宏
以强化培育后草鱼的肠道粘膜为试验材料,采用不同消化法和离心转速梯度分离肠道粘膜细胞团,分别试验不同培养液与不同CO2浓度组合、胎牛血清浓度及细胞接种浓度时细胞生长效果,并且观察草鱼原代肠道粘膜细胞生长过程,同时采用3种细胞形态观察法、MTT检测法及相关酶活力系统评价细胞培养效果。结果表明:采用机械刮取消化法,分离转速为400 r/min,在使用M199培养液、6%CO2、15%胎牛血清、接种浓度为2×103(个/孔)条件下可批量复制草鱼原代肠道粘膜上皮细胞;细胞增殖过程符合动物原代肠道粘膜上皮细胞生长分化规律,采用荧光倒置显微镜与Giemsa染色法相结合、MTT检测法、AKP酶活力及LDH/M...
关键词：
草鱼 肠道粘膜细胞 分离方法 原代培养
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙裴 张彦明 张浩 高春生 张为民 王晶钰 郭抗抗 党如意
【目的】探索鸡气管上皮细胞(chicken trachea epithelium,CTE)分离培养技术,并研究传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)在CTE中培养特性。【方法】利用气管灌注冷消化法分离培养CTE,对CTE特异性8/18角蛋白作免疫组化鉴定上皮细胞。培养的CTE分别接种IBVM41株和T株,分别在接种后第12～96小时观察接毒细胞形态学变化,应用电镜技术观察CTE细胞病变和病毒粒子结构,利用RT-PCR技术检测CTE中病毒核酸并对CTE中IBV的血凝性和鸡胚致病性进行检测。【结果】利用灌注冷消化法可以获得形态完整并带有纤毛的CTE,细...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孙秀梅 程帆 刘维 孙涛 薛秀恒 李培英 王菊花
【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能...
[期刊] 华北农学报
[作者]
霍爱华 孙雪荣 于文慧 李华涛 李乐 李洪才 田文儒
拟探讨热应激诱导ＬＬＣ－ＰＫ１细胞线粒体凋亡相关因子的表达和活性情况，以及激活线粒体凋亡通路的时间。采用ｑＲＴ－ＰＣＲ方法和ＣａｓＰａｓｅ活性检测试剂盒分别检测４２℃热应激处理后０，２，４，８，１６ ｈ以及３７℃培养的ＬＬＣ－ＰＫ１细胞中ｈｓＰ７２、ＢＣＬ－２、Ｂａｘ、ａＩＦ和ＣｙＴ．Ｃ的基因表达以及ＣａｓＰａｓｅ－９和ＣａｓＰａｓｅ－３的活性。结果显示，４２℃热应激１ ｈ，ＬＬＣ－ＰＫ１细胞ＢＣＬ－２／Ｂａｘ（Ｐ＜０．０５）和ａＩＦ（Ｐ＜０．０１）基因表达以及ＣａｓＰａｓｅ－３（Ｐ＜０．０１）；ｈｓＰ７２基因表达和ＣａｓＰ．．．
关键词：
热应激 猪肾小管上皮细胞 线粒体凋亡
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
林红英 沈子龙 王伟强 张弈华 陈虹
用剪切及剪切加胰蛋白酶法消化兔泪腺组织,获取兔泪腺上皮细胞,设计相应的培养基,进行组织块原代培养或混合消化原代培养,用免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果表明,组织块在体外培养10 d,可见上皮样细胞从植块边缘长出,2周后泪腺上皮细胞在培养瓶底部铺成单层,经传代3次,角蛋白染色阳性细胞纯度达90%以上;用混合消化法接种的细胞生长相对较慢。结果提示:用剪切组织块进行培养的方法简便易行,易获得符合要求的兔泪腺上皮细胞。
关键词：
兔 泪腺 上皮细胞 原代培养 鉴定
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
姜茂成 詹康 严康 赵倩明 赵国琦
在体外分离培养奶牛瘤胃上皮细胞,可为奶牛瘤胃生理功能和吸收机制研究和永生化奶牛瘤胃上皮细胞奠定基础。通过胰蛋白酶消化法从奶牛瘤胃组织中分离出瘤胃上皮细胞,并通过免疫细胞化学的方法检测细胞角蛋白,CCK-8检测细胞生长曲线,β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老以及细胞染色体核型分析来鉴定瘤胃上皮细胞。结果表明:1)利用胰蛋白酶消化法可以稳定的培养出瘤胃上皮细胞并且能够在体外传代大约5代;2)通过在显微镜下进行细胞形态的观察呈单层"岛屿状";3)在荧光显微镜下细胞角蛋白抗原能够发出绿色荧光;4)奶牛瘤胃上皮细胞传
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李小芬 詹康 张响英 陶勇 杨晓志 顾文婕
为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
庄利利 胡德宝 蔡丽娟 张也 李钟淑 方南洙
为研究输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎发育质量及胚胎对共培养细胞活力和基因转录量的影响,探索输卵管上皮细胞共培养促进小鼠早期胚胎发育的机理,建立纯化的小鼠输卵管上皮细胞系并对合子进行共培养,用DCHFDA测定胚胎内部的H2O2含量,以MTT法测定输卵管上皮细胞活力,用RT-PCR检测CAT及GPX的转录状况。结果表明:1)共培养能够提高2-细胞早期、4-细胞期胚胎发育率(0.951 3%VS 0.903 3%,0.857 6%VS0.700 5%,P0.05);2)2-细胞早期胚胎内部的H2O2含量显著降低(0.047 9VS ...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘雨曦 孙亦如 王思进 马思思 喻伟峰 尹绍武 王涛
应激反应对暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)养殖业危害极大，而皮质醇(Cortisol)是判断鱼类应激反应的重要标志物。肠道是鱼体与外界环境接触的媒介，肠道生理状态能反应鱼体的应激水平，但目前肠道在鱼类响应应激反应中的作用不详。本研究以暗纹东方鲀肠上皮细胞为对象，分别采用胰蛋白酶和DMEM培养基、胰蛋白酶和1640培养基、Ⅰ型胶原酶和DMEM培养基、Ⅰ型胶原酶和1640培养基4种方法对其进行原代培养，旨在建立暗纹东方鲀原代肠上皮细胞体外培养方法，并在此基础上探讨皮质醇对暗纹东方鲀肠上皮细胞氧化应激、细胞凋亡和脂代谢的影响。利用CCK-8法检测肠上皮细胞活力，透射电镜观察皮质醇处理后细胞内线粒体的形态结构，荧光定量PCR (qRT-PCR)检测氧化应激相关基因、细胞凋亡相关基因及脂代谢相关基因在肠上皮细胞内的表达模式，Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡等。结果显示，在4种培养方法中，采用胰蛋白酶消化和DMEM培养基进行培养的肠上皮细胞增殖率最高，贴壁情况最佳；与对照组相比，当皮质醇浓度高于2 000 nmol/L时，肠上皮细胞活力显著下降(P<0.05)；透射电镜显示，所有皮质醇处理组肠上皮细胞内线粒体结构发生改变，线粒体数量增加；随皮质醇处理浓度的升高，肠上皮细胞内氧化应激相关基因(sod、cat和gsh-px)及促凋亡基因(caspase-3、caspase-7、caspase-9、bax和p53)表达量和凋亡指数均显著上升，抗凋亡基因bcl-2表达量显著下降(P<0.05)；脂肪合成相关基因(g6pd、6gpd、pparγ、fas和acc)表达量显著下降，脂肪分解相关基因(hsl、pparα、lpl和cpt-1)表达量显著上升(P<0.05)；TG和TC含量显著下降，NEFA含量显著上升(P<0.05)。结果表明，皮质醇能够促进暗纹东方鲀肠上皮细胞的氧化应激和细胞凋亡，同时促进脂肪的分解并抑制脂肪的合成。本研究以期为暗纹东方鲀抗应激养殖提供一定的参考资料。
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