采用酶学分析法,检测饲养条件下三种不同食性鱼类前、中、后肠上皮细胞刷状缘膜(BBM)上蔗糖酶、麦芽糖酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶和琥珀酸脱氢酶的活力。结果表明:(1)蔗糖酶和麦芽糖酶活力在三种鱼BBM上的分布表现出一致性,加州鲈(Micropterus salmoides)和草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为前肠>中肠>后肠,湘云鲫(Carassius auratus)为中肠>前肠>后肠,草鱼的蔗糖酶和麦芽糖酶比活力显著性高于湘云鲫和加州鲈(P<0.05);(2)加州鲈和草鱼的γ-谷氨酰转肽酶主要分布在前肠和中肠,而湘云鲫主要分布在中肠和后肠,碱性磷酸酶在三种鱼的肠...

以强化培育后草鱼的肠道粘膜为试验材料,采用不同消化法和离心转速梯度分离肠道粘膜细胞团,分别试验不同培养液与不同CO2浓度组合、胎牛血清浓度及细胞接种浓度时细胞生长效果,并且观察草鱼原代肠道粘膜细胞生长过程,同时采用3种细胞形态观察法、MTT检测法及相关酶活力系统评价细胞培养效果。结果表明:采用机械刮取消化法,分离转速为400 r/min,在使用M199培养液、6%CO2、15%胎牛血清、接种浓度为2×103(个/孔)条件下可批量复制草鱼原代肠道粘膜上皮细胞;细胞增殖过程符合动物原代肠道粘膜上皮细胞生长分化规律,采用荧光倒置显微镜与Giemsa染色法相结合、MTT检测法、AKP酶活力及LDH/M...

为观察不同浓度枯草芽孢杆菌肽聚糖对β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)诱导的鲤幼鱼肠上皮细胞炎性损伤的保护作用,将原代培养72 h(26°C、6%的CO2)的24孔鲤幼鱼IECs培养板随机设为6组,每组4个重复。其中1组为阴性对照,其余5组用浓度为1.0 mg/m L的枯草芽孢杆菌肽聚糖诱导24 h后,分别更换浓度为0(阳性对照)、0.15、0.30、0.45和0.60 mg/m L枯草芽孢杆菌肽聚糖培养液,相同条件培养12、24和36 h,分别检测细胞的抗超氧阴离子(ASA)和抗羟自由基(AH

为探讨益生性枯草芽孢杆菌对肠上皮细胞黏附及对嗜水气单胞菌的抑制作用,以草鱼肠上皮细胞为研究对象,检测了枯草芽孢杆菌对肠上皮细胞的黏附率、对嗜水气单胞菌的黏附抑制率和对各种生理生化指标的影响。结果显示:枯草芽孢杆菌对草鱼肠上皮细胞形态、细胞中四甲基偶氮唑盐(MTT)OD值、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(AKP)和谷草转氨酶(GOT)活性等各种生理指标无显著影响,但在孵育3h和6h后分别显著降低了Na+,K+-ATP酶和谷丙转氨酶(GPT)的活性;与嗜水气单胞菌孵育3h后,肠上皮细胞由椭圆变成不规则形态,

【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18(ETEC F18)引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1的CDS区第307位点处的突变(G→A),建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系(GG、GA和AA)。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上...

【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能...

探讨了健康鲫(Carassius auratus)幼鱼肠道上皮细胞的原代培养方法。结果显示,用含有抗生素、胶原蛋白酶Ⅰ、EDTA和胶原蛋白酶Ⅳ组成的D-Hanks液消化无菌分离的鲫肠道可以获得大量细胞团及绒毛隐窝;用含有抗生素、胎牛血清(FBS)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素的DMEM培养液进行培养,并根据肠道上皮细胞与成纤维细胞贴壁时间的差异进一步纯化,连续培养12d后可以得到纯化的肠道上皮细胞。

为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小

为研究小肽转运蛋白对小肽转运和吸收机制提供细胞模型,在体外建立原代奶牛小肠上皮细胞分离的方法,采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶混合消化液对奶牛小肠组织进行消化,通过2%山梨醇进行密度梯度离心以去除单核细胞、淋巴细胞和肌细胞;用刮除法、相差消化法和96孔板单克隆方法来纯化奶牛小肠上皮细胞,从细胞形态学、细胞角蛋白18免疫荧光染色和小肠上皮细胞特异性标志蛋白来鉴定奶牛肠上皮细胞。结果表明:1)采用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶联合消化奶牛小肠组织,通过2%山梨醇密度梯度离心可以获得大量的细胞团且48h发生贴壁,但是细胞贴壁

[目的]建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。[方法]合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV) CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2) DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV) Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。[结果]PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10~(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10~(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10~(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(10~(6.0)TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10~(8.75) TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(10~(8.875) TCID_(50)/mL)。[结论]成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

以(30±2.3)g/尾的厚颌鲂(Megalobrama pellegrini)幼鱼为研究对象,采用一次性胸腔注射法,研究了磺胺间甲氧嘧啶钠对厚颌鲂幼鱼谷草转氨酶(GOT)和各丙转氨酶(GPT)活性的影响。结果显示,在同一浓度下,随着给药时间的延长,肝脏、肌肉和鳃组织GOT和GPT活性均呈现先升后降的趋势,最大值基本出现在第21天;在同一时间下,随着给药浓度的增加,GOT和GPT活性出现不规则变化;各组织中GOT和GPT活性大小依次均为肝脏>肌肉>鳃;通过GOT活性变化情况可判断,肝脏、肌肉和鳃组织的休药期分别为24 d、23 d和27d;通过GPT活性变化情况可判断,肝脏、肌肉和鳃组织的休药...

采用单因子静态急性毒性试验方法与加和等毒性溶液法,分别研究了Cu2+、Zn2+、Cd2+对厚颌鲂(M ega-lobrama pellegrini)幼鱼的急性毒性和联合毒性效应。结果显示:3种重金属离子对厚颌鲂幼鱼的毒性由强到弱依次为Cu2+、Cd2+、Zn2+,其中Cu2+对厚颌鲂幼鱼24 h、48 h、72 h、96 h的半致死质量浓度(LC50)分别为0.54 mg/L、0.38 mg/L、0.27 mg/L、0.23 mg/L;Cd2+对厚颌鲂幼鱼24 h、48 h、72 h、96 h的半致死质量浓度(LC50)分别为14.32 mg/L、8.34 mg/L、6.36 mg/L、4.4...

采用一次性胸腔注射法，研究了盐酸环丙沙星对（３０±２．３）ｇ／尾的厚颌鲂（ＭｅｇａｌｏｂｒａＭａ ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ）幼鱼谷草转氨酶（ｇｏＴ）和谷丙转氨酶（ｇｐＴ）活性的影响。结果显示：随着给药时间的延长，厚颌鲂的肝脏、肌肉和鳃组织ｇｏＴ活性呈现不规则变化；随着给药浓度的增加，则出现先升后降，然后趋于稳定的趋势；随着给药时间的延长，试验前期肝脏ｇｐＴ活性基本保持不变，试验中期以后则出现先升后降，然后趋于稳定的趋势，肌肉和鳃组织ｇｐＴ活性呈现先降后升再降的趋势；随着给药浓度的增加，总体则基本呈现不规则变化；盐酸环丙沙星对厚颌鲂幼鱼各组织ｇｏＴ和ｇｐＴ活性大小依次为肝脏＞鳃＞肌肉；通过ｇｏＴ活性．．．

【目的】比较不同消化酶对鸡胚小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)的分离和培养效果及细胞的热应激能力,为后续研究提供依据。【方法】以15日龄鸡胚为研究对象,分别使用0.5 g/L胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合及中性蛋白酶Ⅱ消化分离其小肠上皮细胞。培养不同时间后,观察IECs的生长状态,测定细胞生长活性;通过免疫荧光染色和免疫组化对所得IECs进行鉴定,确定最佳的消化酶。对优化所得鸡胚IECs于42℃分别进行2,3,4 h热应激处理,以37℃处理的IECs为对照,MTT法和流式细胞测定IECs的相对活力和凋亡率。【结果】细胞形态学观察发现,用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离得到了大量小肠绒毛隐窝团块,易贴壁,细胞生长快;用0.5 g/L胰蛋白酶和中性蛋白酶Ⅱ消化分离得到的细胞数量少,贴壁慢。用3种酶消化方法分离的细胞生长曲线均呈"S"形,但用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离的细胞生长曲线峰值较高,细胞活性强;联合消化所得IECs特异性标记抗原均为阳性,免疫荧光阳性率达(92.7±7.9)%,细胞膜质呈棕黄色,而对照组细胞膜质无着色。42℃下热应激3 h后细胞活力极显著下降,凋亡率为(35.96±1.57)%,极显著高于对照组的(0.67±0.02)%,可进行后续试验。【结论】采用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化可得到IECs;42℃下处理3 h是构建IECs热应激模型的条件。