【目的】克隆南瓜实蝇(Bactrocera tau)的气味结合蛋白(odorent binding proteins, OBPs)基因,并分析其相关生物学信息,为了解南瓜实蝇的嗅觉机制提供参考。【方法】基于南瓜实蝇转录组测序结果筛选获得OBPs基因并进行生物信息学分析,通过基因克隆测序验证鉴定OBPs基因,并采用sqRT-PCR检测OBPs在雌、雄虫不同组织中的分布情况。【结果】经PCR产物测序验证和BLAST比对后共鉴定得到6个南瓜实蝇OBPs基因,序列长度在498～955 bp,编码128～314 aa,预测分子量大小为14.67～36.24 kDa,等电点为4.69～8.16,且每个OBP序列的N端均具有16～26 aa组成的信号肽序列,属于1个Minus型和5个Classic型。不同类型的OBPs均具有各自典型保守的Cys位点。6个OBPs分化明显,序列相似度在30%～51%。系统进化树表明,6个OBPs与瓜实蝇(Zeugodacus cucurbitae)的OBPs亲缘关系较近,柑橘大实蝇(Bactrocera minax)次之。半定量RT-PCR检测显示,6个OBPs在雌、雄虫不同组织中均有表达,而OBP14在雄虫腹部不表达,OBP15在雌虫腹部不表达。【结论】上述研究结果为进一步研究南瓜实蝇嗅觉识别分子机制和引诱机制奠定了基础。

利用RT-PCR和RACE方法克隆获得瓜实蝇Bactrocera cucurbitae(Coquillett)普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)基因的cDNA全长序列,命名为BcucOBP。测序结果表明,BcucOBP开放阅读框全长447 bp,编码149个氨基酸。氨基酸序列比对及三维结构同源建模表明,此序列具有OBPs的典型特征,序列中具有6个保守的半胱氨酸和6个α螺旋区域。构建了重组表达载体pET28a(+)-BcucOBP,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在IPTG进...

【目的】克隆与鉴定美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae)气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,并对其序列特征、表达情况、系统发育及蛋白功能进行研究,为深入研究美洲斑潜蝇嗅觉机制提供依据。【方法】通过PCR技术克隆美洲斑潜蝇OBP13编码区全长,用DNAMAN对其进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并使用MEGA6.0构建进化树,进行系统发育分析。通过实时定量PCR对OBP13在美洲斑潜蝇不同组织中的表达情况进行分析。构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白

【目的】克隆斑翅果蝇(Drosophila suzukii)气味结合蛋白56h(odorant binding protein 56h,OBP56h)基因,诱导表达斑翅果蝇OBP56h重组蛋白(DsuzOBP56h),研究其与小分子化合物的结合特性。【方法】通过RT-PCR并设计特异性引物克隆斑翅果蝇OBP56h ORF全长,从NCBI数据库中下载相似度高的昆虫气味结合蛋白序列,进行序列比对和分析。以NdeⅠ和XhoⅠ为酶切位点,将OBP56h连入pET-30a(+)原核表达载体,将重组质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞。扩大培养阳性菌株,并用IPTG诱导表达DsuzOBP56h重组蛋白。收集菌液,通过超声波破碎细胞得到蛋白,利用Ni-NTA柱纯化蛋白,进行Tris-HCl透析,用BCA法测定蛋白浓度。蛋白用50 mmol·L~(-1) Tris-HCl(pH 7.4)稀释至终浓度2μmol·L~(-1),配基用色谱级甲醇稀释至终浓度1 mmol·L~(-1),以4,4′-二苯胺基-1,1′-联萘-5,5′-二磺酸二钾盐(4,4′-dianilino-1,1′-binaphthyl-5,5′-disulfonicacid dipotassium salt,bis-ANS)荧光探针为报告子,利用荧光竞争结合试验检测DsuzOBP56h蛋白与18种候选小分子化合物配基的结合特性。【结果】克隆获得了斑翅果蝇OBP56h的ORF全长,共405 bp,N-端含有19个氨基酸组成的信号肽,具有6个保守半胱氨酸位点,符合OBP的典型特征,与其同属的黑腹果蝇OBP56h进化关系最近。成功连入pET-30a(+)表达载体,在1 mmol·L~(-1) IPTG、28℃条件下诱导DsuzOBP56h蛋白表达,并过柱纯化得到目的蛋白。荧光光谱试验显示,荧光探针bis-ANS与DsuzOBP56h的解离常数为0.9568μmol·L~(-1),适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子;进一步的荧光竞争结合试验表明,在18种候选配基中,苦味物质盐酸小蘖碱和香豆素与DsuzOBP56h的结合亲和性较强,解离常数分别为12.16和17.93μmol·L~(-1),柚皮素与DsuzOBP56h的解离常数为25.32μmol·L~(-1),草莓叶片产生的一种对斑翅果蝇具有吸引作用的挥发性气味物质β-环柠檬醛也能与DsuzOBP56h结合,其解离常数为31.37μmol·L~(-1)。【结论】斑翅果蝇气味结合蛋白OBP56h能与测试的多种植物苦味物质和挥发性气味物质结合,表明DsuzOBP56h很有可能参与斑翅果蝇对食物味觉和嗅觉的识别行为,研究结果可为理解斑翅果蝇的取食行为提供理论依据,并为开展斑翅果蝇的生态防控提供新思路。

根据已经报道的棉铃虫普通气味结合蛋白I(GOBP1)和性信息素结合蛋白(PBP)基因的cDNA序列,设计了2对引物,以烟青虫Helicoverpaassulta触角cDNA为模板,分别进行PCR扩增,获得2条特异性条带,约400bp。将以上两条片段分别连接到T-easy载体上,获得重组子T-GOBP1-Hass和T-PBP-Hass。序列测定和结构分析表明,Hass-GOBP1开放阅读框全长441bp,编码147个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为17.2kD和4.71。Hass-PBP开放阅读框全长405bp,编码135个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.1kD和5.2。Hass-...

橘小实蝇[Bactrocera dorsalis(Hendel)]成虫在提供蛋白+糖、水+糖有选择取食的条件下,16:00-16:30对蛋白+糖访问频次最高,13:00-13:30和14:30-15:00对水+糖访问频次最高.整个试验过程中雄性访问频次稍高于雌性,但不存在统计差异,其中,4、7、10日龄橘小实蝇对蛋白+糖访问频次最高,7、8、9日龄对水+糖访问频次最高.试验中橘小实蝇对食物诱剂访问频次最高的时段为16:00-16:30,访问频次最高的日龄为4、7、10日龄.各日龄和时段橘小实蝇对蛋白+糖的访问频次均比水+糖高,并存在显著差异.

【目的】沙葱萤叶甲(Galeruca daurica)是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础。【方法】基于沙葱萤叶甲转录组数据,利用RACE技术对沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20进行cDNA全长克隆;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;通过原核表达系统表达目的蛋白,并使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行重组蛋白纯化。最后采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)为荧光探针,检测GdauOBP20重组蛋白与13种主要寄主挥发物的结合情况。【结果】GdauOBP20的cDNA全长序列为567 bp(GenBank登录号MK250532),其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构;开放阅读框(ORF)全长为420 bp,编码139个氨基酸。氨基酸序列中含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。预测蛋白三级结构中含有6个α螺旋和两对由半胱氨酸形成的二硫键。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合常数为12.8μmol·L-1,结合能力较好,可作为本试验的荧光报告子。在所测的13种主要寄主植物挥发物中,除与二烯丙基三硫醚无结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯和环庚三烯的结合能力最强,解离常数分别为22.91和26.55μmol·L-1,而与月桂烯结合能力最弱,解离常数为116.29μmol·L-1。【结论】沙葱萤叶甲GdauOBP20能与寄主植物的多种主要挥发性物质结合,推测其可能在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中发挥重要的作用。

[目的]本文旨在鉴定重要农业害虫双委夜蛾(Athetis dissimilis Hampson)的信息素结合蛋白(pheromone binding protein,PBP)基因,并分析其序列和组织表达特征,为进一步研究双委夜蛾的嗅觉感受机制奠定基础。[方法]基于双委夜蛾触角转录组数据获得3个PBP基因(Adis PBP1、Adis PBP2、Adis PBP3)的全长序列,通过RT-PCR对3个基因进行克隆和验证,利用RT-qPCR对3个基因在雌、雄成虫的组织表达谱进行分析。[结果]从双委夜蛾触角中克隆3个PBP基因的c DNA序列,3个基因Adis PBP1、Adis PBP2及Adis PBP3分别编码166、169和164个氨基酸,并具有6个保守的半胱氨酸、N端1个信号肽序列等该类基因的典型特征。聚类分析表明:这3个基因分别被聚到3个不同的PBP分支中,且均与同属害虫二点委夜蛾(Athetis lepigone)的相应PBP最近。表达谱分析显示:3个基因均仅在雌、雄虫触角中高表达; Adis PBP1在雄性触角的表达量显著高于雌性触角,而Adis PBP2和Adis PBP3在两性触角中的表达量相似; 3个基因雄、雌蛾触角的表达量差异(雄∶雌)分别为1.84、1.14和0.95,暗示其在性信息素及其他气味感受中的不同作用。[结论]克隆了双委夜蛾3个PBP基因的c DNA全长序列,明确了3个基因的组织表达谱及雌、雄表达差异,对3个PBP基因的可能功能进行了讨论。

【目的】利用昆虫的嗅觉识别机制,以化学感受蛋白作为潜在的靶标,干扰昆虫的寄主定位及交配等行为,用于害虫综合治理。【方法】克隆并纯化了1个新的苜蓿盲蝽化学感受蛋白Alin-CSP6,进行了113种气味化合物对Alin-CSP6的荧光竞争性结合试验,将荧光竞争结合试验筛选出强结合力的气味标样采用"Y"型嗅觉仪验证行为反应,并采用同源建模的方法构建Alin-CSP6的3D结构。【结果】Alin-CSP6具有较广谱的结合力,能够与醇、醛、酮、酯、萜、芳香族等多种化合物结合并表现较强的结合能力。其中,β-香茅醇(β-citronellol)、反式-2-己烯醛(trans-2-hexene aldehyd...

[目的]本文旨在鉴定重要农业害虫斜纹夜蛾(Spodoptera litura)气味结合蛋白基因GOBP2的顺式作用元件,为揭示GOBP2的转录调控机制和开发基于嗅觉干扰的害虫防治技术奠定基础。[方法]利用5′RACE技术克隆GOBP2的5′UTR,确定转录起始位点;利用染色体步移技术(chromosome walking)克隆GOBP2的5′侧翼区,并利用在线网站预测转录因子结合位点;利用PCR克隆GOBP2的5′侧翼区逐步缺失片段,并构建到pGL3-Basic载体上;将各重组载体分别转染Sf9细胞,48 h后收获细胞并利用双荧光素酶报告系统检测转录活性。[结果]获得斜纹夜蛾GOBP2长23 bp的5′UTR,由此确定GOBP2的转录起始位点。通过染色体步移获得斜纹夜蛾GOBP2的5′端调控区2 025 bp的序列,发现启动子的典型TATA框;针对-1 000 bp序列的转录活性分析表明,最强转录活性区域位于-243～-207 bp,具有1个增强子;此外,在-971～-891 bp及-890～-811 bp各有1个增强子,在-244～-315 bp存在1个沉默子。[结论]获得斜纹夜蛾GOBP2的转录起始位点及顺式作用元件,为进一步研究GOBP2的转录调控机制奠定了基础。

应用RT-PCR扩增结合RACE技术克隆获得斜纹夜蛾触角普通气味结合蛋白2(GOBP2)基因Slit-GOBP2全序列。SlitGOBP2的阅读框全长489bp,编码162个氨基酸残基,预测分子质量和等电点分别为18.16ku和5.43。cDNA和氨基酸序列GenBank登录号分别为EF159979和ABM54824。SlitGOBP2氨基酸序列含6个保守的半胱氨酸位点,具有GOBP2的典型特征,与16种鳞翅目昆虫GOBP2同源性为94%～75%;编码蛋白呈酸性,整个分子呈亲水性,在第40～60位和100位以后的氨基酸表现亲脂性,蛋白质二级结构主要由α螺旋构成。氨基酸序列系统进化树分析表明,S...

【目的】克隆获得中华蜜蜂（Ａｐｉｓ ｃｅｒＡｎＡ ｃｅｒＡｎＡ）Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４基因序列，并对其蛋白结构进行预测，分析其在不同组织和发育阶段的时空表达差异，为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织ｃ ＤｎＡ为模板利用ｒＴ－ｐｃｒ技术扩增和克隆获得Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４ ｃ ＤｎＡ全长序列，并提交至Ｇｅｎ ＢＡｎｋ数据库；利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征；采用ＭｅＧＡ５．２软件中的邻位相连法（ｎｅｉＧｈＢＯｒ－ｊＯｉｎｉｎＧ，ｎｊ）构建Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４及其同源膜翅目昆虫ＯＢｐｓ的系统发育树；通过实时荧光定量ｐｃｒ技术分析Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４在１、５、．．．

针对重要农业害虫大螟,通过序列相似性分析从转录组数据获得2个普通气味结合蛋白(general odorant-binding protein,GOBP)基因cDNA片段,利用RACE技术进一步得到cDNA全长,分别命名为SinfGOBP1和SinfGOBP2。2个基因编码的氨基酸序列和已报道的昆虫同源序列具有较高的相似性,其中SinfGOBP1和黄地老虎、小地老虎的相似性最高,分别为91%和90%;SinfGOBP2和谷实夜蛾、甘蓝夜蛾的相似性最高,均为87%。进化分析表明,不同昆虫GOBP被明显分为GOBP1和GOBP2两个亚组,暗示2个亚组GOBP在功能上的分化;此外,相同亚组内GOBP基...

采用RT-PCR方法扩增、克隆和鉴定了泥蚶(Tegillarca granosa)的金属硫蛋白(Metallothionein,MT)基因(TgMT)的开放阅读框(ORF)。基于金属硫蛋白氨基酸序列构建的系统进化树表明,泥蚶和魁蚶(Scapharca broughtonii)的亲缘关系最近。利用ORF序列,构建原核重组表达质粒。重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序验证后转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导,表达重组蛋白,重组蛋白的分子量约为28.3 kD。可溶性分析表明重组蛋白主要以可溶性形式存在。用His-tag柱亲和纯化重组蛋白,并利用重组蛋白制备...

【目的】研究白蜡窄吉丁气味结合蛋白AplaOBP2在触角中的表达定位,解析AplaOBP2重组蛋白的配体结合特性及配体活性,旨在通过气味结合蛋白筛选白蜡窄吉丁新的信息化合物。【方法】原核表达白蜡窄吉丁气味结合蛋白AplaOBP2,采用免疫组织化学技术研究AplaOBP2在白蜡窄吉丁触角中的表达定位,通过荧光竞争结合试验分析AplaOBP2重组蛋白与58种化合物的结合特性,并进一步通过触角电位仪和"Y"型嗅觉仪测定AplaOBP2的配体对白蜡窄吉丁成虫的活性。【结果】在原核表达系统中成功表达AplaOBP2重组蛋白。免疫定位结果显示AplaOBP2在触角嗅觉感器——锥形感器Ⅰ的淋巴液表达。荧光竞争结合试验结果表明,AplaOBP2蛋白能够与反-2-己烯醛、反-2-庚烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮、3′,4′-二甲氧基苯乙酮和β-紫罗兰酮6种配体结合,其解离常数KD值分别为4.44,4.17,5.20,2.91,3.45和0.63μmol·L-1。白蜡窄吉丁雌雄成虫对10 mg·mL~(-1)的6种配体均有触角电位反应。行为学试验表明,在10 mg·mL~(-1)刺激剂量条件下,反-2-己烯醛对雌成虫有显著引诱作用,β-紫罗兰酮对雌虫表现出明显的趋避作用。【结论】白蜡窄吉丁气味结合蛋白AplaOBP2在嗅觉感器表达,能够选择性结合醛类和酮类物质,推测其在嗅觉识别中发挥功能。气味结合蛋白可作为靶蛋白,鉴定对白蜡窄吉丁具有吸引或趋避活性的信息化合物。