南果梨是典型的呼吸跃变型果实,在室温贮藏条件下果实软化较快,其成熟过程主要受乙烯调控。EIN3(Ethylene Insensitive3)是乙烯信号转导途径中的重要转录因子,接受乙烯信号刺激后与下游基因的启动子结合,激活乙烯信号通路,进而引发乙烯反应并启动果实成熟。EIN3的蛋白水平主要受泛素化途径调控,负责调控EIN3泛素化降解的E3泛素连接酶是一类SCF(SKP1-CUL1-F-box-Rbx1)复合体,其中负责与EIN3识别的是EBF1和EBF2蛋白。但在梨中仍无关于EIN3受泛素化途径调控的相关报道。克隆南果梨中的EIN3基因及泛素化组分EBF1和EBF2,分别命名为PuEIN3,PuEBF1和PuEBF2;并对它们的互作关系进行验证。研究结果表明:PuEIN3全长1824 bp,编码607个氨基酸,含有5个基本结构域,符合EIN3的结构特征。PuEIN3的表达水平在贮藏过程中基本不发生变化;在乙烯和1-MCP处理的情况下,其表达水平也无明显的变化规律;PuEBF1的表达水平在南果梨贮藏过程中呈现先上升后下降的趋势;并且PuEBF1的表达受到乙烯的诱导,其中采后第10天最明显,乙烯处理之后的表达量约为对照的1.5倍;而1-MCP处理之后,几乎检测不到PuEBF1的表达。PuEBF2的表达水平没有明显的变化规律。酵母双杂交和Pull down试验结果显示PuEIN3能够与PuEBF1和PuEBF2互作。研究结果将有助于更加深入了解南果梨果实成熟软化过程,为从分子水平调控果实软化提供理论依据。

信号传导及转录激活因子(STAT)是生物体内重要信号通路JAK/STAT的关键组分,在机体免疫、生长、发育等方面起到重要作用。实验从凡纳滨对虾血细胞中克隆获得了STAT基因的全长cDNA序列(Lv-STAT,GenBank accession number:KC779541),其ORF区全长2 373 bp,编码790个氨基酸,预测的分子量为90.68 ku,等电点为5.91。利用SMART在线软件分析表明,该基因编码的蛋白主要结构域由STAT_int、STAT-α、STAT-β和SH2 domain 4部分组成,但不具有信号肽结构。将Lv-STAT与来源于其它物种的STAT进行氨基酸多序列比...

【目的】克隆3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因,分析其在不同条件下的表达特性;构建植物表达载体并转化烟草,对转基因烟草的耐盐性进行初步鉴定。【方法】根据已获得的cDNA序列设计引物,扩增MsERF5、MsERF8和MsERF11的DNA序列,并分析基因结构;利用半定量RT-PCR技术分析其组织表达特异性和胁迫条件下的表达特性;通过农杆菌介导的方法转化烟草,鉴定盐胁迫条件下转基因烟草的表型和生理生化特性,初步验证其功能。【结果】MsERF5、MsERF8和MsERF11都不包含内含子。MsERF5在根、叶和花蕾中的表达量高于茎和花;MsERF8在根和叶中的表达量高于茎、花蕾和花;MsERF11在叶中的...

为了探讨凡纳滨对虾细胞因子信号转导负调控因子(SOCS)在病毒引发的免疫应答过程中的潜在作用,本实验根据前期的转录组和表达谱结果提示信息,首次克隆了凡纳滨对虾的SOCS基因(Lv-SOCS,GenBank注册号:KJ000426),利用在线软件进行了生物信息学分析,运用半定量的方法进行了组织表达分析,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了该基因在白斑杆状病毒(WSSV)侵染过程中的表达变化特征。结果显示,Lv-SOCS的ORF区1 191 bp,编码397个氨基酸,预测分析显示该基因编码的蛋白质含有1个SH2结构域和1个SOCS-box结构域,组织表达分析表明该基因主要在凡纳滨对虾血细...

大量证据证明钙-钙调素(Ca2+ CaM)信号系统参与植物的热激信号转导。用激光共聚焦扫描显微镜研究小麦胞内Ca2+浓度的变化,37℃热激可引起小麦胞内自由Ca2+浓度的迅速提高。在Ca2+存在条件下,热激也引起小麦CaM基因CaM1-2的表达及细胞内CaM蛋白含量的提高。用CaCl2处理小麦幼苗明显提高小麦热激基因hsp26和hsp70的表达和热激蛋白的合成,而Ca2+的螯合剂EGTA,Ca2+通道阻断剂异博定和LaCl3、CaM抑制剂W7、TFP和CPZ明显降低了热激基因hsp26和hsp70的表达和热激蛋白的合成。EGTA、易博定、TFP或CPZ的处理也阻止小麦耐热性的获得。小麦CaM基...

为了研究CaM和Ca2+在调控乙烯生物合成和信号转导组分基因表达中的相互关系,利用272 mmol/L CaCl2及272 mmol/L CaCl2+100 μmol/L W5(或W7)处理绿熟期番茄果实圆片,然后采用无菌培养的方法在20℃的 条件下进行培养。结果表明:CaCl2处理能够抑制番茄果实圆片的乙烯生成,抑制LeACO1,NR,LeERF2基因的表达, 而CaCl2+W5(或W7)能消除Ca2+对果实圆片乙烯生成及LeACO1,NR,LeERF2基因的表达的抑制作用,但CaCl2和 CaCl2+W5(或W7)处理均对LeACS2基因表达影响不明显。以上研究结果表明外源钙处理对乙烯生物...

【目的】ethylene insensitive 3/ethylene insensitive-like 1(EIN3/EIL1)是乙烯信号通路的重要成员，克隆并分析其在木薯块根采后生理性变质(post-harvest physiological deterioration, PPD)过程中的表达情况，可以为深入研究乙烯信号在木薯块根PPD过程中的功能提供参考。【方法】通过RT-PCR技术从木薯栽培品种SC8中克隆得到了木薯MeEIN3.1基因，然后对MeEIN3.1基因的遗传进化关系、结构域、蛋白质结构、理化性质等进行分析。对MeEIN3.1蛋白进行亚细胞定位，并通过荧光定量PCR和酵母双杂交技术对MeEIN3.1基因在木薯块根PPD过程中的表达水平以及下游互作转录因子进行分析。【结果】MeEIN3.1基因的长度为1 452 bp,编码483个氨基酸残基，等电点和分子质量分别为5.08和55.12 ku,氨基酸序列包含7个EIN3/EIL1结构域，和橡胶HbEIN3-like基因的亲缘关系最近，序列一致性为69.35%。MeEIN3.1蛋白的亚细胞定位结果显示该基因位于细胞核。荧光定量PCR结果显示，在木薯块根的PPD过程中MeEIN3.1基因的表达量和对照0 h相比，表现为显著上升趋势，即MeEIN3.1基因的表达受到PPD过程的诱导。另外，酵母双杂交结果显示MeEIN3.1能够与MeERF1.2和MeERF1.3产生互作。【结论】MeEIN3.1基因的表达在采后过程中受到诱导，推测其通过下游转录因子MeERF1.2和MeERF1.3进行乙烯信号转导来参与木薯块根的PPD过程。

植物系统获得抗性 (SAR) ,是植物受到病原菌侵染后所激发的一种防卫反应。这种反应由植物抗病基因 (R)与病原菌无毒基因 (avr)的相互识别开始 ,由R基因下游的一些基因整合不同的抗病信号 ,通过水杨酸 (SA)将抗病信号传递下去。这一信号途径在SA下游受非诱导免疫 (NIM/NPR)基因的调控 ,激活NPR1可诱导病程相关蛋白 (PR)基因的表达 ,最终建立具有广谱抗性的SAR。SAR信号途径也可由模拟自然信号的化学物质激活 ,这些激活剂的应用是发展绿色化学农药的新思路。

[目的]本文旨在探究乙烯信号通路转录因子EIL1对番茄果实形成的作用。[方法]以EIL1过量表达转基因番茄(EIL-OX)、EIL1共抑制表达转基因番茄(EIL-CS)、EIL1启动子驱动GUS报告基因的转基因番茄(PE1∷GUS)和DR5启动子驱动GUS报告基因转基因番茄(DR5∷GUS)为材料,采用RT-qPCR和ELISA等技术研究在番茄果实形成过程中EIL1的转录变化和生长素水平变化;通过杂交、Ag+处理以及GUS染色,分析乙烯和生长素在番茄果实形成过程中的互作机制。[结果]RT-qPCR结果显示,在番茄果实形成和成熟的过程中Sl EIL1基因的表达量呈"升高-降低-升高"的趋势。表型分析发现,EIL-OX植株较矮,叶片小且向地生长,出现大量侧枝,部分花蕾凋亡且植株提前衰老; EIL-CS植株自交形成的胚珠发育异常,产生无籽果实,同时ELISA检测表明EIL-CS植株果实发育过程中生长素含量高于EIL-OX和野生型植株。GUS染色结果显示,PE1∷GUS植株EIL1在萼片中大量表达,DR5∷GUS植株生长素主要分布在果柄、萼片处,且授粉后萼片与子房交接处的生长素含量降低。EIL-OX/DR5∷GUS和Ag+处理的野生型植株中生长素主要出现在果柄处。[结论]EIL1能够阻碍生长素从果柄向子房运输,授粉受精或下调表达EIL1均能解除这种阻碍,提高子房生长素水平,形成果实。

[目的]制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。[方法]构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。[结果]成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。[结论]成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。

【目的】S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）、1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶（ACS）和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（ACO）是植物合成乙烯的3个关键酶，从全基因组水平鉴定龙眼SAMS、ACS和ACO(Dl SAMS、Dl ACS和Dl ACO）基因家族，并进行生物信息学、体细胞胚早期不同阶段及不同浓度1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）和不同处理时间下龙眼胚性愈伤组织的表达模式分析，为进一步研究和利用Dl SAMS、Dl ACS和Dl ACO基因家族奠定基础。【方法】从拟南芥数据库（TAIR）下载SAMS、ACS和ACO家族蛋白质序列作为参考序列，TBtools、NCBI Blast等工具搜索龙眼基因组数据库，鉴定Dl SAMS、Dl ACS和Dl ACO基因家族。使用Ex PASy、Predi Si、TMHMM Server 2.0、Net Phos 3.1 Server、Plant-PLoc、MEME、Plant CARE、STRING、TBtools等软件和在线工具预测Dl SAMS、Dl ACS和Dl ACO家族成员蛋白质基本理化性质、保守基序（Motif）与互作关系，定位染色体，分析基因共线性与选择压力、基因结构及启动子顺式作用元件；Clustal W和MEGA-X软件对龙眼、拟南芥、番茄、水稻和玉米的SAMS、ACS和ACO家族成员蛋白质序列分别进行多序列比对、构建系统进化树；根据龙眼转录组数据库的FPKM值，应用TBtools软件绘制Dl SAMS、Dl ACS和Dl ACO家族成员在体细胞胚早期不同阶段的表达热图；采用q RT-PCR法分析不同浓度ACC和不同处理时间下龙眼胚性愈伤组织Dl SAMS、Dl ACS和Dl ACO家族成员的表达情况。【结果】龙眼第三代基因组中分别鉴定获得SAMS、ACS和ACO家族成员4个、11个和4个，在家族成员数量上与拟南芥、番茄等物种差异不大。Dl SAMS家族成员最保守，所有成员的Motif相同；Dl ACS和Dl ACO家族成员也含有较多保守的Motif。3个家族共19个成员分布在11条染色体上，有6对共线性基因，与拟南芥有30对共线性基因，均受纯化选择作用。3个家族的成员均含有大量光、激素和逆境响应元件。家族成员内部的蛋白互作关系较弱，但家族成员之间互作关系非常紧密。多物种系统进化关系表明，SAMS、ACS和ACO家族均可分为3个亚家族，Dl SAMS家族成员仅分布在SAMS-Ⅰ和SAMS-Ⅱ中，SAMS-Ⅲ可能为单子叶植物所特有；Dl ACS和Dl ACO家族成员在3个亚族中均有分布，且分布较为均匀；Dl SAMS、Dl ACS和Dl ACO均与番茄和拟南芥的SAMS、ACS和ACO亲缘关系较近。对转录组FPKM值的分析表明，Dl SAMS家族的所有成员以及Dl ACO4B在体细胞胚早期的3个阶段均高表达，可能在体细胞胚发生过程发挥着重要作用；Dl ACS1和Dl ACS6B在球形胚阶段高表达，可能与球形胚的形成密切相关。在胚性愈伤组织继代培养基中添加不同浓度的ACC能显著影响龙眼胚性愈伤组织的增殖量及Dl SAMS、Dl ACS和Dl ACO家族成员的表达。培养20 d时，主要表现为基因的上调表达，且ACC浓度越高，上调越明显；在25—35 d则主要表现为基因的下调表达。但是在20 d时，0.01 mmol·L~(-1) ACC处理的基因主要表现为下调表达，这可能是导致其增殖量显著大于对照的原因。【结论】龙眼第三代基因组中分别有SAMS、ACS和ACO家族成员4个、11个和4个，在进化过程中的保守性均较高，且包含大量激素和逆境响应元件；3个家族成员对龙眼体细胞胚胎的发生起重要调控作用，0.01 mmol·L~(-1) ACC处理可能通过调控Dl SAMS、Dl ACS和Dl ACO家族成员的表达促进龙眼胚性愈伤组织增殖。

高温是制约坛紫菜(Neoporphyra haitanensis)产业发展的主要因素之一，阐明坛紫菜高温胁迫应答机理对耐高温品种选育至关重要。人们已分离多个坛紫菜抗逆相关基因，但尚不清楚这些基因的表达调控机制。本研究通过分子生物学和生物信息学技术分离了坛紫菜转录因子NhbZIP1基因。该基因开放阅读框长825 bp，编码274个氨基酸。从开放阅读框推导的氨基酸序列有5个低复杂度区域和1个BRLZ结构。其中，BRLZ是bZIP家族的保守结构域，含有一个α卷曲螺旋结构(121～171 aa)。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现，NhbZIP1受高温胁迫显著诱导。为进一步阐明NhbZIP1的功能，将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中。结果显示，高温胁迫下转基因藻株生物量始终高于野生型，且随处理时间增加差异越来越显著。转基因藻株中热激蛋白家族和抗氧化系统相关基因的表达量显著高于野生型。研究表明，NhbZIP1激活下游抗逆基因表达，在坛紫菜应答高温胁迫中发挥重要作用。研究结果有助于阐明bZIP调控坛紫菜响应高温胁迫的分子机制，为耐高温新品种选育提供了基础信息。

高温是制约坛紫菜(Neoporphyra haitanensis)产业发展的主要因素之一，阐明坛紫菜高温胁迫应答机理对耐高温品种选育至关重要。人们已分离多个坛紫菜抗逆相关基因，但尚不清楚这些基因的表达调控机制。本研究通过分子生物学和生物信息学技术分离了坛紫菜转录因子NhbZIP1基因。该基因开放阅读框长825 bp，编码274个氨基酸。从开放阅读框推导的氨基酸序列有5个低复杂度区域和1个BRLZ结构。其中，BRLZ是bZIP家族的保守结构域，含有一个α卷曲螺旋结构(121～171 aa)。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现，NhbZIP1受高温胁迫显著诱导。为进一步阐明NhbZIP1的功能，将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中。结果显示，高温胁迫下转基因藻株生物量始终高于野生型，且随处理时间增加差异越来越显著。转基因藻株中热激蛋白家族和抗氧化系统相关基因的表达量显著高于野生型。研究表明，NhbZIP1激活下游抗逆基因表达，在坛紫菜应答高温胁迫中发挥重要作用。研究结果有助于阐明bZIP调控坛紫菜响应高温胁迫的分子机制，为耐高温新品种选育提供了基础信息。

为研究仙人掌多糖(ODPs)对Toll样受体4(TLR4)及其转导的MyD88依赖性信号途径中下游重要元件髓样分化因子88(MyD88)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、IκB激酶β(IKKβ) mRNA和蛋白表达的影响,体外培养小鼠腹腔单核巨噬细胞(RAW264.7),用ODPs干预24h,收集细胞,分别采用RT–PCR法和蛋白质印迹Western blot法检测TLR4、MyD88、TRAF6、IKKβmRNA及蛋白表达。结果显示:中、高剂量(100、200μg/mL)ODPs显著增强TLR4、TRAF6及IKKβ的基因表达及TLR4、MyD88、TRAF6的蛋白表达(P<0.05),且具有良好的量效关系;ODPs也显著降低了MyD88的基因表达(P<0.05),对IKKβ的蛋白表达量增强效果不显著。说明非炎性条件下ODPs可促使TLR4高表达,同时激活TLR4胞内信号转导的MyD88依赖性途径。

以过表达前系统素转基因番茄（３５Ｓ∷ｐｒｏＳｙＳ）、茉莉酸合成突变体番茄（Ｓｐｒ２）和野生型番茄（ＷＴ）为试验材料，研究了其被棉铃虫取食后叶片保护酶活性和防御反应基因表达情况，以及对棉铃虫抗性的影响．结果表明：棉铃虫取食不同基因型番茄叶片后，多酚氧化酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶和脂氧合酶活性在３５Ｓ∷ｐｒｏＳｙＳ植株中最高，在ＷＴ植株中次之，在Ｓｐｒ２植株中最低．荧光定量ｐＣｒ检测表明，棉铃虫取食不同基因型番茄叶片后，脂氧合酶基因、丙二烯氧化物环化酶基因和蛋白酶抑制剂基因的转录水平在３５Ｓ∷ｐｒｏＳｙＳ植株中最高，在ＷＴ植株中次之，而在Ｓｐｒ２植株中这些抗性基因的表达未受到虫害的诱导．生物测．．．