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[期刊] 水产学报
[作者]
林娜 马德蓉 刘志东 倪玲 段蕊 张俊杰
为了探究南极磷虾致敏问题，从南极磷虾中筛选、鉴定、分离纯化其主要过敏原，并对过敏原的性质进行研究，实验通过缓冲盐溶液提取南极磷虾蛋白；采用SDS-PAGE和Western blot (WB)筛选南极磷虾过敏原；使用高效液相色谱-串联质谱鉴定过敏蛋白；通过等电点沉淀、硫酸铵盐析、阴离子交换柱层析分离纯化过敏原；采用SDS-PAGE及WB分析南极磷虾主要过敏原的耐热性及对模拟胃肠液的消化稳定性。结果显示，南极磷虾肌浆蛋白(SP)和肌原纤维蛋白(MF)电泳条带丰富且分子量范围广。南极磷虾蛋白与虾蟹过敏患者血清能发生免疫反应，其中至少有4个蛋白条带发生了阳性反应；免疫反应最强烈的蛋白分子量约为35 ku，能够被所有的患者血清识别，经液质联用鉴定此过敏蛋白为南极磷虾原肌球蛋白(TM)。硫酸铵分级盐析纯化TM的最佳饱和度为50%；分离纯化后得到了纯度较高的TM，其等电点为4.4，热稳定性好，能与虾蟹过敏患者血清发生强烈的免疫反应。TM随着模拟胃液消化时间的延长，主条带分子量逐渐降低，最后稳定在33 ku左右，并且分子量为15和12 ku的降解片段含量逐渐增多且稳定存在；这些降解条带仍然能与过敏患者血清发生较强的免疫反应。随着模拟肠液消化时间的延长，TM原始片段逐渐减少直至消失，最后完全降解成分子量更小的多肽；TM经肠液消化后其降解产物免疫活性大大降低。研究表明，南极磷虾中存在过敏原，TM是其最主要的过敏原，且具有免疫反应性。TM还具备了过敏原的一般特性，比如耐高温、耐胃蛋白酶消化、对胰蛋白酶消化部分稳定。研究结果对于阐明南极磷虾潜在致敏问题的预警和防控具有现实意义，也为南极磷虾加工利用及过敏原消减技术构建提供基础信息。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
荣雅利 周婷婷 施文正 汪之和 李燕
南极磷虾生活在在极寒环境，其体内特殊的蛋白酶系统是其维持正常新陈代谢的关键因素。羧肽酶为南极磷虾蛋白酶系统中一类主要且关键的蛋白酶，酶学性质研究对其后续基础研究开展及商业利用都具有指导意义。本研究以南极磷虾为原料，采用缓冲液提取、硫酸铵分级盐析，DEAE-琼脂糖凝胶FF阴离子层析和Sephadex G-100凝胶层析，从南极磷虾匀浆液中分离纯化出一种羧肽酶，SDS-PAGE结果显示其分子量为30ku。酶学性质研究结果显示：该酶最适温度为30℃；最适pH为8.0。热稳定性较差，即使在4℃下保温超过2h酶活性会急剧下降。金属离子Ni~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Mg~(2+)具有激活作用，且激活作用依次增强；而Ca~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)起抑制作用，Cu~(2+)抑制效果最明显。对巯基有修饰作用的抑制剂DTT、β-巯基乙醇对其有抑制作用，推测该酶活性中心存在二硫键；金属蛋白酶抑制剂EDTA、1,10-菲罗啉对该酶活性有明显的抑制作用，说明了其具有金属蛋白酶特性；而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该酶抑制作用并不强烈。以脲酰-L-苯丙氨酸为底物溶液，测得该酶Km为0.0059mg/mL、Vmax为4.9091U/min。
关键词：
南极磷虾 羧肽酶 分离纯化 酶学性质
[期刊] 水产学报
[作者]
王晓斐 李振兴 林洪 杜亚楠
以中国对虾为研究对象,旨在获得有关中国对虾过敏原的基础数据,为水产品中过敏原的控制提供依据。首先利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对中国对虾过敏原组分进行分析,经免疫印迹鉴定其主要过敏原。然后利用高效液相色谱法纯化中国对虾的主要过敏原,并用β消去、紫外扫描、肽质量指纹图谱和红外光谱等方法对其理化性质进行研究。表明中国对虾主要过敏原为分子量36ku的糖蛋白,糖含量为4.4%,存在O-型糖肽键,其二级结构主要为α-螺旋,与其他甲壳类过敏原之间存在很高的同源性。
关键词：
中国对虾 过敏原 鉴定 肽质量指纹图谱
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
田鑫 汪之和 施文正 李燕
以南极磷虾(Euphausia superb)为研究对象,通过硫酸铵分级沉淀、Phenyl-Sepharose疏水层析、DEAE-Sepharose FF离子交换层析等方法,从南极磷虾体内分离纯化出胰蛋白酶。其纯化倍数为5.44倍,比活力为38.3 U/mg,得率为26%。SDS-PAGE电泳结果显示,该酶的分子质量为28 ku。蛋白酶最适温度为37℃、最适pH为7.5,Mg2+、Ca2+、Mn2+对南极磷虾蛋白酶具有激活性,Zn2+、Cu2+、Fe3+具有酶活抑制性,其中Cu2+的抑制性最强。酶的动力学实验结果表明,以BApNA为底物测得Km为0.073 mmol/L,Vmax为1.44×1...
关键词：
南极磷虾 蛋白酶 纯化 酶学性质
[期刊] 水产学报
[作者]
汪宁 蔡秋凤 刘光明 陈昭华 王锡昌 苏文金 曹敏杰
小清蛋白是鱼类的主要过敏原,对该蛋白的研究不仅有利于过敏原检测方法的建立也可为低致敏性水产品的开发提供理论依据。通过组织捣碎、冷冻离心、热处理、Superdex75凝胶过滤等方法从鲢白色肉中纯化得到过敏原小清蛋白。Tricine-SDS-PAGE显示,在非还原条件下,该蛋白呈分子量分别为12ku、14ku、24ku的3个条带。而在还原条件下,仅有分子量为12ku的条带。Western-blotting分析表明,分子量为12ku、14ku和24ku的这3个条带都与小鼠抗蛙小清蛋白单克隆抗体(PARV-19)发生特异性反应,提示它们均为小清蛋白的不同形态。用纯化的小清蛋白制备多克隆抗体,经Prot...
关键词：
鲢 小清蛋白 纯化 多克隆抗体
[期刊] 水产学报
[作者]
李振兴 林洪 李明华 曹立民
The consumption of seafood is widespread in China.The increase in the rate of seafood allergies,as well as their persistence and severity,become an important food safety issue.To improve seafood allergy patients' life quality,it is important to find a kind of seafood which has little or even none al...
关键词：
过敏 虾类 过敏原性 食品安全
[期刊] 水产学报
[作者]
蔡秋凤 王锡昌 刘光明 罗志湖 曹敏杰
原肌球蛋白(TM)是甲壳类动物的主要过敏原,其氨基酸序列具有很高的保守性。本研究以口虾蛄为研究对象,旨在探明TM是否是其主要过敏原并对其相关性质进行研究。利用过敏患者血清通过免疫印迹法确定口虾蛄的主要过敏原分子量约为36ku。通过制备丙酮粉、等电点沉淀、硫酸铵盐析及加热等方法纯化了该主要过敏原。采用抗中华绒螯蟹TM多克隆抗体进行免疫学性质分析表明该蛋白为TM。抑制性免疫印迹和抑制性ELISA实验表明口虾蛄TM与凡纳滨对虾和锯缘青蟹等甲壳类动物的TM具有较强的免疫交叉反应,但与贝类动物杂色蛤的免疫交叉性较低。通过ELISA方法对甲壳类动物的TM进行定量测定,结果表明,口虾蛄肌肉中TM的含量约只有...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
赵侠 李燕 孙慧敏 郑昌亮 宋益善
食源性二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV）抑制肽和抗氧化肽分别有助于清除体内自由基和调节机体血糖。为实现脱脂南极磷虾粉的高值化利用，为糖尿病治疗寻找新方法，从脱脂南极磷虾粉酶解产物中制备DPP-IV抑制肽和抗氧化肽。使用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰酶水解脱脂南极磷虾粉，探究时间与水解度、活性、产率的关系，并分离纯化多肽，最后通过分子对接确定抑制作用位点。结果表明，酶解液经超滤、Sephadex G15分离纯化和液相-质谱联用技术鉴定后，得到了4条具有DPP-IV抑制和抗氧化作用的肽，氨基酸序列分别为WPPLSPFRCPR、IPDWFLNRQ、FLWLKKTPLPL和DTVPWFPR。其中IPDWFLNRQ具备较高DPP-IV抑制活性，DPP-IV抑制活性IC_(50)值为（0.616±0.097) mmol/L；WPPLSPFRCPR具有较高的抗氧化活性，DPPH EC_(50)值为(0.0983±0.011) mmol/L，ABTS EC_(50)值为(0.116±0.073) mmol/L。分子对接结果表明这4种肽主要通过氢键与DPP-IV活性中心及其以外的位点相结合，从而达到抑制DPPP-IV活性的作用。本研究基于脱脂南极磷虾粉制备食源性DPP-IV抑制肽和抗氧化肽，以期为南极磷虾粉的开发利用提供理论依据。
[期刊] 水产学报
[作者]
刘一璇 林洪 吴丽莎 陈瑜 王国英 李振兴
选取冻干、烘干、虾丸化以及油炸4种加工方式处理刀额新对虾,通过检测可溶性蛋白、主要过敏原含量和免疫活性的变化以及体外模拟胃液消化实验,分析加工方式对虾类过敏原免疫活性及抗酶解能力的影响。结果表明经过不同的加工处理后,分子量为35 ku左右的主要过敏原蛋白仍然存在,免疫印迹显示其免疫活性有不同程度的下降,其中虾丸化处理对免疫活性的降低程度最大,达87%,冻干处理的影响最小,仅达6.8%;而主要过敏原蛋白抗酶解能力变化不明显。结论:不同的加工方式对虾过敏原活性的降低有比较大的差异,但对于抗酶解能力影响不大。
关键词：
刀额新对虾 加工 过敏原 过敏活性
[期刊] 水产学报
[作者]
姚翠鸾 王志勇 张瑞英 韩学哲 张子剑 孔鹏 冀培丰 黄珊珊
经过CM-纤维素批量层析、Separdex G-100柱层析、DEAE-纤维素柱层析等步骤,从凡纳滨对虾肌肉组织分离得到精氨酸激酶,经SDS-PAGE检测达到电泳纯,分子量约为40kDa。对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降;pH8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用,高浓度时表现抑制作用,而底物类似物精胺和氨基胍则对酶促反应表现出完全的抑制。NaCl,KCl对酶的活力具有促进作用,低浓度(10mmol.L-1)MgCl2对酶活力表现出激活作用,而CuCl2与MnCl2则表现出完全抑制酶活力,CaCl2与ZnCl2在低浓度...
关键词：
凡纳滨对虾 精氨酸激酶 纯化 性质
[期刊] 水产学报
[作者]
郑礼娜 林洪 刘一璇 李钰金 李振兴
选取煮(100℃)、蒸(100℃)、高压(121℃,0.1 MPa)这3种常见热加工方法,分别处理刀额新对虾不同的时间,通过检测总可溶性蛋白、主要过敏原含量和免疫活性的变化,分析3种热加工方式对虾类过敏原免疫活性的影响,并通过质地剖面分析,研究虾肉经过处理后组织结构的变化。经过3种热处理后,分子量为36 ku的主要过敏原蛋白仍然存在,免疫印迹的结果显示其免疫活性有不同程度的下降,高压对免疫活性的降低程度最大,30 min时免疫活性降低了97%;在25～35 ku区域出现一条新的IgE结合蛋白。质构分析结果显示,经过高压热处理后,虾肉的硬度和咀嚼度都有很大程度的降低,口感变差。结果表明:热高压处...
[期刊] 水产学报
[作者]
吴玟静 李振兴 金科 郑礼娜 王邦平 林洪
选择青岛地区喜食的阿拉斯加狭鳕、蓝点马鲛、大黄鱼、真鲷、鲑、大菱鲆、鲤等7种鱼为研究对象,利用鱼类过敏患者血清,通过SDS-PAGE及免疫印迹方法对每种鱼的过敏原蛋白进行鉴定。利用兔抗鲅鱼小清蛋白多克隆抗体,通过间接ELISA和抑制性ELISA等对7种鱼的小清蛋白之间的交叉反应进行探讨。结果表明,青岛地区居民鱼类过敏原主要为48～57、33～41、28及17 ku的蛋白,和传统公认的小清蛋白为主要过敏原的共识不同。而针对小清蛋白的交叉反应研究也表明,不同鱼类蛋白之间存在强烈的交叉反应。因此,虽然鱼类过敏原可能不同,但如果对以上7种鱼中的一种鱼过敏,最好不要食用其他任何一种鱼。
关键词：
鱼 过敏原 鉴定 交叉反应
[期刊] 水产学报
[作者]
吴丽莎 李振兴 刘一璇 陈瑜 林洪
采用凡纳滨对虾为研究对象,分别将过敏原提取物在-3,-20和-80℃的贮存条件下反复冻融1～5次,通过测定每次冻融后的蛋白浓度,过敏原免疫原性等探讨过敏原在不同温度循环下的变化,分析冻融循环对过敏原提取物活性的影响。结果表明,虾过敏原提取物在-80、-20、-3℃冻融循环5次时,蛋白浓度分别下降33.1%、30.0%和24.2%;在-80和-20℃冻融循环4次时,主要过敏原条带发生降解,-3℃冻融循环5次,主要过敏原条带不会发生变化。在-80和-20℃冻融循环5次以及在-3℃冻融3次时,过敏活性降低;在-80和-20℃冻融5次,主要过敏原的免疫印迹条带消失,在-3℃冻融的免疫印迹条带没有变化。...
关键词：
凡纳滨对虾 过敏原 冻融 免疫原性
[期刊] 水产学报
[作者]
刘光明 黄园园 蔡秋凤 翁凌 苏文金 曹敏杰
采用Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)方法,通过模拟肠胃液消化实验分析淡水鱼类肌肉中主要过敏原小清蛋白(parvalbumin,PV)的消化特性。Tricine-SDS-PAGE结果显示,纯化的鲫、鲢PV在模拟胃液消化实验中反应5～30min明显分解,而在模拟肠液消化实验中4h仍未见明显分解。鲫、鲢肌浆蛋白在模拟胃液消化实验中,肌浆蛋白中的PV比纯化PV的分解时间明显延长,消化30～60min仍未被完全分解,而其它肌浆蛋白消化10～30min就完全分解。采用抗PV多克隆抗体的Western-blot显示,...
[期刊] 世界农业
[作者]
刘欣 姚晗珺
随着人类对自身安全意识的增强,对过敏原进行严格管理将成为工业食品的重要发展趋势。而中国目前还未对这方面进行系统研究和规范,因此,本文通过对欧盟、美国、日本、韩国、澳大利亚、新西兰以及中国香港等国家和地区有关过敏原的法规和管理机制进行对比分析,并提出完善中国食品过敏管理的建设性意见。
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