从南极获得的260株低温细菌中筛选到107株具有蛋白酶活性菌株,其中5株菌所产蛋白酶的活性高于45U/mL。对其进行16SrRNA基因序列的同源性和系统发育分析,结果表明,菌株NJ276、NJ59、NJ1670、NJ345属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas),NJ341属于科尔韦尔氏属(Colwellia)。对其中NJ276、NJ341、NJ1670、NJ345这4株产蛋白酶南极嗜冷菌的生长及分泌蛋白酶的部分酶活特性进行研究,结果表明:(1)4株菌最适生长、产酶温度均为10℃左右;培养2～5d,嗜冷菌生长、产酶量一直处于较高的状态。(2)4株南极嗜冷菌分泌的蛋白酶的酶活反应...

从慕士塔格峰江布拉克冰川融水中筛选获得一株耐低温蛋白酶细菌菌株Ｐ３－１，１６Ｓ ｒ ＤＮＡ序列分析鉴定为假单胞菌，其分泌的蛋白酶最适催化温度为２５℃，符合低温酶特性．通过单因子筛选及正交试验优化Ｐ３－１发酵条件，确定其最佳产酶培养基配比为：３．０％葡萄糖、１．５％蛋白胨、０．３％Ｍｇ ＳＯ４，最适宜培养条件为：接种量３％，Ｐ Ｈ ７．０，发酵时间４２ Ｈ．在此条件下菌株发酵产酶活力可达８２．１ Ｕ·Ｍ Ｌ～（－１），是最初（３７．３ Ｕ·Ｍ Ｌ～（－１））的２．２倍．

【目的】从新疆东帕米尔高原布伦口湖群湿地分离产蛋白酶耐低温细菌,对其进行初步分类鉴定,为后续低温酶制剂的研究应用奠定理论基础。【方法】利用脱脂乳选择培养基筛选产低温蛋白酶菌株,并对其表型特征、生长特性及产酶性状等进行研究,结合16S rRNA基因序列确定布伦口湖群湿地产低温蛋白酶功能菌株的遗传多样性及分类地位。【结果】共筛选出6株产蛋白酶菌株,其在15℃条件下均能生长繁殖,属耐冷菌,但耐盐性一般,能在低温条件下发酵产酶,生长稳定期达到产酶高峰。16S rRNA基因序列初步确定4株为假单胞菌(Pseudom

通过初筛从健康青年鸡肠道内容物中分离到67株产蛋白酶菌株,采用酪蛋白平板法进行复筛,并对P-98菌株进行形态特征观察、生理生化试验和16S rDNA基因的序列分析。将该菌株的形态特征和生理生化特性鉴定结果与相应种、属模式菌的性状比对,菌株P-98与芽孢杆菌的相应性状相近。根据16S rDNA基因序列相似性分析,此菌株与Bacillus methylotrophicus标准菌株FZ42相似度达99.78%,因此鉴定该菌株P-98为Bacillus methylotrophicus。

为获得性状稳定、高产的碱性蛋白酶菌株,采用平板诱变法对产碱性蛋白酶菌株进行诱变处理。结果表明,采用牛奶平板法及Folin测酶活法从鸡粪土样获得产碱性蛋白酶出发菌株。该菌株经亚硝基胍(NTG)诱变并利用利福平抗性株筛选获得蛋白酶活力为出发菌株34,65倍的2个变异株。因此,利用亚硝基胍作为诱变剂可产生高产酶菌株。

采集渔-稻复合系统中的水稻根际淤泥,筛选出有较强产胞外蛋白酶能力的菌株并研究环境因素对其产酶活性的影响。结果显示,通过初筛、蛋白酶复筛等筛选得到一株菌株(编号PRO9);此菌株所产产胞外蛋白酶能够促进水体中有机物质发生氨化反应,减少有机氮含量。此菌还具有产胞外碱性磷酸酶的能力。菌株鉴定结果显示此菌为芽孢杆菌。PRO9菌株所产的胞外蛋白酶在67℃下酶活性最为活跃,最适pH为7,属于中性蛋白酶。

【目的】利用Fosmid文库功能筛选法,获得山羊瘤胃微生物源蛋白酶基因并进行原核表达。【方法】利用功能底物筛选法从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选具有蛋白酶活性的克隆子,对其进行Illumina二代测序,对预测到的基因进行功能注释,根据基因丰度结果确定后续研究的功能基因。利用大肠杆菌BL21(DE3)对功能基因进行诱导表达,对表达产物进行酶活性测定。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,将密码子优化后的功能基因分别敲入枯草芽孢杆菌C6基因组ctc位点并进行表达验证。【结果】从Fosmid文库1 700个克隆子中筛选到1个具有蛋白酶活性的阳性克隆Pro4-C5。通过二代测序技术,鉴定出3个潜在的蛋白酶基因gene0833(内肽酶,EC编号:EC3.4.21.53)、gene0196(金属内肽酶,EC编号:EC3.4.24)和gene0585(羧肽酶,EC编号:EC3.4.17.14)以及1个L-天冬酰胺酶基因(gene0683,EC编号:EC3.5.1.1)。以p ET-28a(+)为表达载体,通过大肠杆菌BL21(DE3)原核诱导表达发现,gene0585和gene0196未表达;gene0833表达的蛋白分子质量为87 ku,蛋白酶活性为10.45 U/mL;gene0683表达的蛋白分子质量为37 ku,L-天冬酰胺酶活性为88.52 U/mL,同时发现该蛋白也具有蛋白酶活性,酶活性为5.25 U/mL。将密码子优化后的gene0683和gene0833定点敲入枯草芽孢杆菌C6基因组中表达发现,gene0833未表达,gene0683表达的蛋白酶活性为109.72 U/mL,相比原始菌株(100.97 U/mL)显著提高了8.67%(P<0.01);L-天冬酰胺酶活性为31.63 U/mL,相比原始菌株(22.79 U/mL)显著提高了30.06%(P<0.01)。【结论】从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选和鉴定出了2个具有蛋白酶活性的功能基因(gene0833和gene0683),均来源于微小杆菌属(Exiguobacterium),其中gene0683在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达产物具有较高的蛋白酶和L-天冬酰胺酶酶活性。

【目的】解析Streptomyces sp. DJ菌株编码的3种角蛋白酶的氨基酸序列、二级结构、三级结构及其功能的关系。【方法】基于DJ菌株全基因组测序结果,利用Bio-edit、DNAMAN、Discovery Studio2.5等软件、https://swissmodel.expasy.org/等网站对其3种角蛋白酶的序列和结构进行了分析和预测。【结果】DJ菌株胞外分泌3种角蛋白酶(K1、K2和K3)均属于S8家族的丝氨酸蛋白酶,信号肽、前导肽和成熟肽在氨基酸残基的组成、极性和长度等方面较一致。3种酶均能以5WSL.1.A为模板进行同源建模,每种酶的3-D结构中均含有6个α螺旋、2个3_(10 )α螺旋和15个β折叠的二级结构;其中K1酶含有2个二硫键,1Ca和2Ca位点,K2和K3各有1个二硫键,1Ca位点;3种酶的Pro270残基位于loop环,而仅有K2的Pro242残基位于loop环中。3种酶底物结合区域主要由疏水性残基构成,偏向于疏水性强的底物。3种酶的底物结合区域比较而言,S1和S2对底物特异性起关键作用;由于3种酶的S1和S2中重要位点残基的不保守性,使其底物特异性具有差异。【结论】DJ菌株中3种角蛋白酶在氨基酸、二硫键、脯氨酸和钙结合等的不同致使酶稳定性的不同;并且由于其表面电荷分布、底物结合区域的差异构成对羽毛水解位点的互补性,这可能是DJ菌株高效降解羽毛的重要原因。

以北京、大连和日本3个产地的纳豆产品为试验材料,从中筛选可用于畜禽生产的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)蛋白酶高产菌株。先通过酪蛋白平板初筛得到9株芽孢杆菌,再以N1型纳豆芽孢杆菌为模式菌株,对初筛得到的菌株进行菌落和菌体形态观察、生理生化鉴定,确定有5个菌株为纳豆芽孢杆菌。测定5个菌株48 h发酵液中蛋白酶活性,结果表明:菌株NB1为蛋白酶高产菌株,发酵液中蛋白酶活性为19.41 U.mL-1,产蛋白酶特性在6代内可保持稳定。

采用复性电泳技术,研究环境pH、温度及培养时间对哈维氏弧菌TS-628菌株胞外产物(ECP)蛋白酶活性的影响。结果表明,胞外产物蛋白酶最适反应pH在8.5左右,酸对ECP蛋白酶活性的抑制明显强于碱对它的抑制作用;最适反应温度在20～50℃之间,20℃以下或50℃以上蛋白酶活性则受到明显抑制,表明蛋白酶不仅对高温敏感,对低温也很敏感;培养12h的胞外产物蛋白酶活性最强。最适温度和pH条件下,主要出现3种蛋白酶,其中分子量为94kDa和26kDa的两种蛋白显示了很强的蛋白酶活性,而且能在比较极端的温度和pH值条件下保持活性,而分子量为35kDa蛋白酶只在最适反应条件下出现,并且该蛋白酶的最适反应条...

通过生理生化、分子生物学、单因子优化等方法研究了来自南海海域一株产中性蛋白酶菌株S-3685,并对其在250 ml摇瓶中的培养条件进行了优化。结果显示,该菌株初步确定为芽孢杆菌属(Bacillus),发酵培养的最佳碳、氮源分别为葡萄糖10 g/L和豆面10 g/L,牛肉膏5 g/L,酵母膏5 g/L。无机盐Mg SO4·7H2O、Na2CO3、KH2PO4最佳浓度分别为0.2 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L;菌株在培养基起始p H=7.0、4%接种量、15 ml/250 ml(v/v)装液量和30℃的条件下,发酵72 h获得较高的酶产量。在最佳培养条件下产酶量为4250 U/ml,是优...

【目的】鉴定新的家蚕蛋白酶抑制剂,探讨其在抵御病原微生物入侵方面的功能。【方法】对家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI37进行T-A克隆、多序列比对、系统发育树构建、原核表达、RT-PCR时空表达特征及微生物诱导分析。【结果】克隆、表达了1个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂,命名为BmSPI37。时空表达特征分析表明,BmSPI37在家蚕5龄幼虫后期表达量很高,而且在中部丝腺中高量表达;在蛹向蛾的变态发育时期,BmSPI37在雌蚕中的表达量显著高于雄蚕。微生物诱导试验表明,BmSPI37在大肠杆菌、黑胸败血菌、球孢白僵菌感染后,强烈上调表达。【结论】推测BmSPI37与防御病原微生物入侵有关。

以酪蛋白为底物 ,对常规蛋白酶检测方法进行改进并与偶氮酪蛋白法进行比较 ,建立适应病毒微量蛋白酶的快速检测方法。结果表明 ,改进的微量蛋白酶检测方法具有微量、快速、灵敏度高的特点 ,适于病毒微量蛋白酶的检测。蛋白酶的最低检出量可达ng级。

为探讨均四甲苯的微生物处理方法,研究了本实验室筛选的蛋白酶生产菌J6对均四甲苯的降解特性。将J6接入装有50mL发酵液的250mL摇瓶中,发酵液中均四甲苯含量为50g.L-1。将摇瓶置于30℃,180r.min-1的摇床中培养,分析均四甲苯对微生物生长进程的影响,以及微生物生长过程中均四甲苯的含量变化。结果表明:该菌在含有均四甲苯的培养基中能稳定生长,且比不含均四甲苯的培养基具有更长时间的稳定生长期(在实验室条件下长达200h);对发酵液的分析表明,该菌在发酵11h后,发酵液中均四甲苯的含量迅速降至0.746g.L-1,24h内降解率达91.6%。可见,J6菌能有效降解均四甲苯,有望将该菌用于...

从腐烂浒苔和浒苔暴发区域的海水中筛选出具有纤维素分解能力的菌株,采用刚果红染色法进行粗选,得到8株透明圈较大的菌株。将8株菌株分别接种到3种不同碳源的液体发酵培养基,发酵培养6 d后,分别测定滤纸(FPA)酶活力、羧甲基纤维素(CMC)酶活力与水解浒苔纤维素的效果。8株菌株中得到H3、H4、H6、Q1四种产酶较好的菌株并鉴定。3种液体发酵培养基中,以羧甲基纤维素钠为碳源的条件下,H3的CMC酶活力最高,为56.98 U/mL。H3与H4的浒苔水解效果较好,还原糖得率分别为10.4%和12.8%。