【目的】基于单细胞测序技术探究绒山羊毛乳头细胞标记基因，优化毛乳头细胞体外鉴定的方法，为研究绒山羊毛囊发生发育提供良好的细胞模型。【方法】运用Seurat单细胞分析法分析陕北白绒山羊胚胎期60、90、120 d皮肤组织的单细胞测序数据。原始数据经质控、过滤、标准化后，采用UMAP方法进行数据降维与聚类分析。通过对比已报道的毛囊相关标记基因，获得完整绒山羊毛囊细胞类群谱系信息。通过基因差异表达分析，筛选绒山羊毛乳头细胞特异性标记基因。利用免疫荧光试验鉴定标记蛋白在绒山羊皮肤组织中的表达与分布情况，进一步筛选毛乳头区域特异性表达蛋白。体视镜下机械分离完整绒山羊毛囊，采用酶消化法分离绒山羊毛乳头区域并在体外培养至细胞分离，最终通过差速贴壁法纯化细胞。待毛乳头细胞纯度较高时，利用免疫荧光试验验证候选标记蛋白在分离细胞中的表达情况。【结果】从单细胞水平分析了绒山羊毛囊发生过程中涉及的关键细胞转录信息，成功获得绒山羊皮肤中的17个主要细胞类群信息，鉴定出包括真皮细胞谱系、表皮细胞谱系、毛乳头细胞、毛干细胞、内根鞘细胞等绒山羊皮肤结构关键细胞类群，以及周皮细胞、巨噬细胞、肌肉细胞等其他功能细胞类群。筛选获得毛乳头细胞特异性基因427个，包括SOX2、FGF7、APOD、BMP3、HHIP、HEY2和SPON1等，这些基因在绒山羊毛乳头细胞中的表达丰度远高于其他细胞类型，被认为是毛乳头细胞特异性标记基因。组织免疫荧光试验进一步证明SOX2、FGF7与APOD等蛋白在绒山羊毛乳头区域内特异性表达，可用于皮肤组织中绒山羊毛乳头细胞的定位。此外，本研究在成功分离单根绒山羊次级毛囊的基础上，实现了绒山羊毛乳头区域的贴壁培养，成功观测到大量细胞从毛乳头区域逐步迁移分离的过程。细胞免疫荧光试验结果显示SOX2、FGF7与APOD均在绒山羊毛乳头细胞中表达，且SOX2阳性细胞约占毛乳头细胞总量的76%左右，而FGF7和APOD阳性细胞则占98%以上。结合绒山羊皮肤组织免疫荧光定位结果，SOX2、FGF7与APOD等标记可用于鉴定体外分离培养的绒山羊毛乳头细胞。【结论】利用单细胞测序技术描述了绒山羊主要皮肤细胞的转录组信息，筛选出毛乳头细胞特异性表达基因。经免疫荧光试验证实，单细胞测序鉴定标记基因的方法简单高效，且具备较高准确率。筛选的SOX2、FGF7与APOD不仅为绒山羊毛乳头细胞体内定位提供了有效的标记，而且为多标记鉴定毛乳头细胞提供可能，更为进一步研究毛囊发育相关基因的功能及调控机制奠定重要基础。

在山羊真皮毛乳头细胞中,建立MSX2基因过表达细胞株和MSX2基因干扰细胞株,通过生长曲线比较各细胞株的增殖能力,再通过Real-time PCR和Western Blot检测各株细胞中MSX2、LEF-1、cyclin D1基因的m RNA表达水平和蛋白质表达水平。结果表明,分离得到的山羊真皮毛乳头细胞均表达α-SMA和CD133表面标记,鉴定该细胞即为真皮毛乳头细胞。通过Real-time PCR检测各细胞株MSX2的表达量,发现在初级毛乳头细胞中过表达试验组是对照组的11.85倍,干扰试验组是对照组的0.31倍;而在次级毛乳头细胞中过表达试验组是对照组的10.59倍,干扰试验组是对照组的0.45倍,表明MSX2基因过表达和干扰细胞系已被成功建立。与此同时,研究中还发现,随着MSX2表达水平的增加,LEF-1和cyclin D1的表达水平也同步增加,同时使真皮毛乳头细胞增殖能力增强;随着MSX2表达水平的下调,LEF-1和cyclin D1的表达水平也同步减少,同时使真皮毛乳头细胞增殖能力下降。旨在探究MSX2基因在山羊真皮毛乳头细胞增殖中的调控模式,并为深入研究山羊毛囊的发生与生长提供理论基础。

[目的]明确白蜡及白蜡高级烷醇吐温水溶液对人真皮乳头细胞(HFDPCs)生长的影响。[方法]采用台盼蓝法测定细胞的的接种数量,接种第2天给药,给药48 h后采用MTS法研究不同浓度吐温80、白蜡及白蜡高级烷醇吐温水溶液对人真皮乳头细胞的作用。[结果]人真皮乳头细胞在吐温80用量1.56 6.25μg·m L(-1)范围内能正常生长。在安全范围内,白蜡(增溶量为0.31 1.25μg·m L(-1))吐温水溶液、白蜡高级烷醇(增溶量为3.12 12.5μg·m L(-1))吐温水溶液均能促进人真皮乳头细胞的

【目的】利用体细胞核移植技术克隆陕北白绒山羊优秀种公羊个体。【方法】以特别优秀成年陕北白绒山羊种公羊耳部皮肤成纤维细胞为供体细胞,体外培养成熟的陕北白绒山羊卵母细胞作为受体,利用显微操作方法对成熟卵母细胞进行去核操作,然后将供体细胞注射到其卵周隙内,经电融合将其导入去核卵母细胞内形成核移植重组胚。利用钙离子载体Ionomycine联合蛋白酶抑制剂6-甲基氨基嘌呤(6-DMAP)对核移植重组胚进行激活处理,挑选激活后完整的胚胎继续进行体外培养,然后在2～16细胞期时将克隆胚胎移植到相应的同期发情受体母羊体内,利用PCR-RFLP技术鉴定克隆羊。【结果】构建了体细胞核移植胚胎253枚,重组胚胎的融...

【目的】长江三角洲白山羊是我国及世界上唯一能生产优质笔料毛的山羊品种,课题组前期转录组测序结果表明:在优质笔料毛与非优质笔料毛个体皮肤组织中,MAP3K1的表达水平存在显著差异。探究优质笔料毛性状形成过程中与MAP3K1相互作用的关键miRNAs及其对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响,为长江三角洲白山羊的分子选育提供理论依据。【方法】通过生物信息学网站(Str Base、miRDB、Target Scan、miRWalk、DAVID、KEGG、RNAhybrid)预测、筛选与MAP3K1具有靶向关系的miRNAs,利用在线网站Venny 2.1绘制韦恩图。通过构建miR-31-5p过表达载体,MAP3K1、RASA1野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,验证miR-31-5p与MAP3K1、RASA1之间的靶向关系,并结合qPCR和Western Blot技术检测过表达后miR-31-5p对MAP3K1、RASA1 m RNA和蛋白表达水平的影响。为探究过表达miR-31-5p后对细胞增殖、凋亡的影响,分析了转染miR-31-5p后毛囊干细胞内增殖相关基因(PCNA, CDK1, CCND2)、抗凋亡基因(Bcl-2)和促凋亡基因(Bax)的m RNA和蛋白表达水平;同时结合CCK-8,Ed U,流式细胞术等方法验证过表达miR-31-5p对毛囊干细胞活力、细胞周期以及凋亡的影响。【结果】通过数据库共同预测到3个可能与MAP3K1相作用的miRNAs,结合现有miRNAs在皮肤和毛囊细胞上研究,最终选用评分相对较高的miR-31-5p作为研究对象。转染miR-31-5p后检测细胞内的miR-31-5p的相对表达量,发现miR-31-5p表达含量极显著高于对照组及空白载体组(P<0.01);双荧光素酶报告基因结果显示过表达miR-31-5p可促使MAP3K1活性升高(P<0.01)。CCK-8结果显示过表达miR-31-5p后提高了细胞增殖能力(P

以陕北白绒山羊毛囊生长期皮肤组织cDNA为模板,扩增出Lhx2基因的CDS区,成功构建了以KAP6.1为启动子表达Lhx2基因的绿色荧光表达载体pIRES2-KAP-LHX-EGFP.并利用脂质体介导转染绒山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系,经PCR检测显示外源基因已整合到细胞基因中.研究结果为进一步开展Lhx2基因对绒山羊毛囊发育的影响和转Lhx2基因绒山羊的生产提供了前期研究基础.

单细胞转录组测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)技术是在单个细胞水平通过对mRNA进行高通量测序研究其整体水平基因表达情况的一项新技术。本研究概述了scRNA-seq技术的发展历程和创新;详细介绍了scRNA-seq技术的单细胞捕获/分选、反转录/PCR扩增、建库测序和测序数据基础分析等步骤,以及在植物单细胞图谱、非生物胁迫响应机制、细胞分化发育、转录因子调控网络等研究中的应用;剖析了该技术在甘薯中单细胞图谱、分化、抗逆和基因方面的应用潜力;最后对该技术的应用进行了展望。

随着对环境微生物生态系统认知的深化，对其深入研究的需求持续增加，传统的培养组学和环境DNA测序等研究手段已经难以满足对微生物物种和功能多样性的全面了解。单细胞分选与测序技术为环境微生物研究开创了全新的视角，成为该领域的热点与前沿。单细胞技术将微生物研究的焦点从群落水平深入到个体细胞层面，通过精准分选并测序单个微生物细胞，深入挖掘微生物的种间和种内多样性以及功能特性。本综述介绍单细胞技术在环境微生物研究中的应用，详细论述单细胞分选和基因组扩增的关键过程，并探讨单细胞测序数据解析过程中的生物信息学基本流程，为单细胞分选与测序技术在环境微生物研究中的发展提供借鉴和启示。

【目的】研究产绒量居全国第一的中国特有种质资源-辽宁新品系绒山羊和产绒质量居全国第一的内蒙古阿尔巴斯绒山羊系统发生地位。【方法】通过PCR方法,对两种绒山羊16个个体的细胞色素b核苷酸同源区进行序列的测定,并进行比较分析。【结果】序列分析结果表明,序列全长为1140bp,定义了11种单倍型,单倍型比例为68.75%,说明辽宁新品系绒山羊和内蒙古阿尔巴斯绒山羊的遗传多态性比较丰富。利用分子钟,计算物种的分歧时间,绒山羊与山羊属其它山羊的分歧的时间大约是0.4万年,山羊属和岩羊属的分歧时间大约是3～6百万年,山羊属与绵羊属的分歧时间大约是4～7百万年。【结论】本试验成功地测定和分析两种绒山羊的细胞...

【目的】研究云南半细毛羊毛囊干细胞(Hair follicle stem cells,HFSCs)的分离培养方法。【方法】用组织块法原代培养云南半细毛羊HFSCs,并进行细胞纯化和传代培养,培养液为无血清培养液DMEM/F12+40ng/mL bFGF+20ng/mL EGF+20μL/mL B27+100IU/mL青霉素+100IU/mL链霉素。对建立的细胞系进行免疫组化、RT-PCR和流式细胞术鉴定。【结果】HFSCs体积小,为贴壁生长细胞,呈典型的铺路石状,核质比高,在倒置显微镜下胞体透亮、折光性强

为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小

对山羊子宫内膜基质细胞进行分离与体外培养,研究其生长特性,并对其进行免疫细胞化学染色鉴定。结果表明,山羊子宫内膜在37℃条件下,以2 g／L的胶原酶Ⅰ型消化3～4 h效果最好;采用过滤—低速离心—沉降相结合的方法分离山羊子宫内膜基质细胞效果较好,所得细胞在培养后0．5 h开始贴壁,培养12 h后,可见梭形和多角形2种形态的细胞,3～4 d呈网状铺满皿底,有明显的重叠生长现象;免疫细胞化学染色显示这2种形态的细胞均表达波形蛋白,阳性率可达95％以上,不表达角蛋白。说明采用本文所述的消化和分离方法可获得高纯度的子宫内膜基质细胞。

公元前299年,发生了一件匪夷所思的外交事件。秦国国君秦昭王邀请楚国国君楚怀王到武关(陕西商南)举行一个小型峰会,就彼此关心的国际问题交换意见。秦国的邀请函是这么说的,但后来事态的发展出乎所有人的预料。楚怀王一到武关,秦昭王直接扣押了他,并且进一步劫持到秦国首都咸阳,强迫楚怀王割让巫郡(四川巫山)、黔中郡(湖南吉首)。楚怀王此时像条"汉子",愤怒地加以拒绝,秦昭王就永久地扣留了他。"国不可一日无君",楚国只好重新立了一个国君(楚顷襄王)。

【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164(vascular endothelial growth factor 164,VEGF164)基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV(6.3 kb)。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基...

　通过有效的细胞培养方法获得山羊乳腺上皮细胞系,对这些细胞形态进行光镜观察,结果发现,细胞可形成闭合型和开放型细胞群,闭合型细胞群边界清晰,细胞之间结合紧密;开放型细胞群边界不清,细胞相互分散存在于一局限的范围内。乳腺上皮细胞与成纤维细胞混生时分区生长,界线明显;细胞之间形成许多腔状结构。纯化的乳腺上皮细胞通过单细胞悬浮后传代,部分细胞形成岛屿状聚集,部分细胞以贴壁的自由单个细胞散在形式存在。上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状(称之为乳球体);乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁,分泌到细胞外的乳汁流动形成网状结构。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠...